引用格式：宋　雯，陈　曦，余　君，等. 地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵产香及菌演替的影响[J]. 湖南农业科学，2023（8）：69-75.　DOI:
DOI:10.16498/jki.hnnykx.2023.008.015
2021年国产手工雪茄销量超过2 000万支[1]，但国产雪茄烟叶香气不够浓郁、化学成分不协调[2]，因此需要通过微生物、酶及一些化学作用共同完成雪茄烟叶的发酵以提升烟叶品质。利用生物发酵技术改善雪茄烟叶品质成为了一大研究热点[3]。微生物的生长代谢使得烟叶中的木质素、蛋白质等生物大分子降解或转化，形成一系列的挥发性香气物质，同时降低烟叶中的青杂气，进而提升发酵后烟叶品质[4-5]。迟建国[6]为了降低烟叶中木质素含量，从废弃烟草中筛选出一株白腐菌并用于烟叶发酵，使得发酵后烟叶木质素含量降低30%，并显著提升了烟叶品质；蔡文等[7]为了降低烟叶蛋白质含量，采用源自烟叶的高斯芽孢杆菌进行发酵，降低了烟叶总氮含量，且提高了烟叶中β-紫罗兰酮、E-大马士酮等类胡萝卜素降解产物的含量。张倩颖等[8]使用冬虫夏草菌株发酵烟叶，提高了发酵后烟叶中茄酮等西柏烷类降解产物的香气含量，且感官质量评价明显提升。地衣芽孢杆菌作为一种遗传背景清楚的益生菌[9]，被广泛应用于食品发酵等[10-11]，许多发酵食品特征性风味化合物与地衣芽孢杆菌代谢特征关系密切[12-13]。目前地衣芽孢杆菌在烟草领域主要作为根际促生菌用于育苗过程[14-15]。
雪茄发酵过程中菌演替规律对科学可控地设计雪茄发酵工艺具有重要意义[16]。由于传统分离培
地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵产香及菌演替的影响宋　雯1，陈　曦1，余　君2，胡路路1，陈　雄1，王　志1
（1. 发酵工程教育部重点实验室，湖北工业大学，湖北武汉  430068；
2. 湖北省烟草科学研究院，湖北武汉  430030）
摘　要：为揭示施加地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵的影响，结合宏基因组学技术对雪茄烟叶发酵后香气物质生成、菌演替及其功能多样性进行了分析，探讨了各菌属在香气物质形成中的作用，揭示了菌演替特征与代谢功能变化。结果表明：地衣芽孢杆菌的添加改变了雪茄表面微生物落结构，提升了烟叶表面物种的丰富度，增强了氨基酸的生物合成、碳代谢等多个主要代谢通路的活性，使得发酵后烟叶中苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物和美拉德反应产物的含量分别提高了36%、44%、11%和18%，提升了香气醇厚感和烟叶整体平衡感。
关键词：宏基因组；地衣芽孢杆菌；雪茄烟叶；致香成分
中图分类号：TS453；Q811.3      文献标识码：A      文章编号：1006-060X（2023）08-0069-07
 E ffect of Bacillus licheniformis on the Fermentation and Flavor Production of Cigar Tobacco
and Flora Succession
S ONG Wen1，CHEN Xi1，YU Jun2， HU Lu-lu1, CHEN Xiong1, WANG Zhi1
（1. Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, PRC; 2. Tobacco
Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, PRC）
Abstract：To reveal the influence of Bacillus licheniformis application on the fermentation of cigar tobacco leaves, the aromatic components formation, and microbial community succession and its functional diversity after fermentations of tobacco leaves were analyzed by combining metagenomics technology. The role of bacterial flora in the formation of aroma components was clarified, and the characteristics of microbial community succession and their distributions of metabolic function were revealed. The results showed that the application of Bacillus licheniformis changed the microbial community structure and enhanced the richness of the microbial community on the surface of tobacco leaves, which enhanced the activity of several major metabolic pathways such as amino acid biosynthesis and carbon metabolism. The content of phenylalanine conversion products, carotenoid degradation products, cembranoid degradation products, and Maillard reaction products i
n the fermented tobacco was increased by 36%, 44%, 11%, and 18%, respectively, which enhanced the aroma mellowness and the overall balance of the tobacco leaves.
Key words：metagenomics; Bacillus licheniformis; cigar tobacco; aroma-causing components
收稿日期：2023-04-12
基金项目：国家其他部委项目（110202001039）
作者简介：宋　雯（1999—），女，湖北孝感市人，硕士研究生，研
究方向为风味产品发酵技术。
通信作者：王　志
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023年8月
养技术的局限性，即使选择多种培养基和分离条件，也仅能从样品中分离出少量优势菌[17]。而宏基因组测序技术可克服此缺陷，检测出样品中全部微小生物的基因组DNA [18]，全面地反映其微生物落的真实组成，系统地分析发酵过程中核心微生物菌和代谢通路的变化，并注释风味物质形成的相
关基因。刘爱平等[19]通过宏基因组技术研究了四川麸醋的微生物组和风味形成相关基因，发现醋醅具备通过氨基酸代谢形成风味物质的基础。陈晓东等[20]通过宏基因组测序技术分析了不同产地的酸笋中菌结构和代谢通路的差异，发现酸笋中的微生物差异与产地密不可分。
conversion翻译方法的定义笔者在雪茄烟叶箱式发酵过程中施加地衣芽孢杆菌，结合宏基因组学技术研究了其对雪茄烟叶发酵后香气成分的影响，揭示发酵后雪茄烟叶发酵菌系的演替特征以及其与香气物质代谢的关系，为构建雪茄烟叶发酵香气物质代谢网络、提升其代谢效率提供有力支撑。
1　材料与方法
1.1　试验材料
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）：从茄芯CX-14表面分离得到，制备甘油管保藏于发酵工程教育部重点实验室。
LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，氯化钠 10 g/L，pH值 7.2~7.4，121℃灭菌20 min。
洗涤缓冲液：Tris-HCl 15.76 g/L，EDTA-Na2 18.612 g/L，NaCl 81.9 g/L，polyvinylpyrrolidone (PVP) 20 g/L，Tween-20 1 g/L，pH值8.0。
1.2　方　法
1.2.1　菌株的活化　取200 μL甘油管保藏的地衣芽孢杆菌菌液接种到LB液体培养基中，200 r/min培养24 h得到一级种子液；按接种量5%将一级种子液接种至LB液体培养基中，200 r/min培养24 h得到二级种子液。
1.2.2　雪茄烟叶恒温恒湿箱发酵　整箱烟叶重量25 kg。测定雪茄烟叶初始含水率，按照称重回潮法计算所需回潮水的量，使烟叶回潮至含水率34%，待水分平衡后装入纸箱，放入恒温恒湿培养箱中，37℃、80% 湿度进行发酵（对照组）。按照接种量2×108 CFU/g 计算所需菌体的量，将地衣芽孢杆菌二级种子液以10 000 r/min的速度离心5 min后弃上清收集菌体，加入计算好的回潮水进行重悬，得到的菌悬液均匀喷洒在烟叶表面（地衣芽孢杆菌组）。发酵周期为30 d。
1.2.3　雪茄烟叶挥发性香气成分测定及感官评价　样品预处理：样品去主脉后烘干，用粉碎机粉碎后过40目筛后，使用同时蒸馏萃取装置提取致香物质[21]，使用GC-MS进行分析。GC-MS谱条件如下。谱柱：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：40℃保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，然后10℃/min升至280 ℃；载气（He）流速1 mL/min；进样量1 μL；分流比10∶1。电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230℃；质量扫描范围35~550 m/z。目标化合物的峰识别基于国家标准和技术研究所数据库（NIST14）进行对比。
感官评价参照覃明娟等[22]报道的方法，由湖北省烟草科学院完成。
1.2.4　雪茄烟叶宏基因组样品采集、宏基因提取及测序　取10 g叶片样品，剪切成段，加入100 mL洗涤缓冲液超声15 min后过滤，将收集到的滤液10 000 r/min 离心10 min，弃上清收集微生物细胞，重复洗涤直至上清液几乎无。放入液氮罐中冷冻30 s后迅速转入－80℃保存。宏基因提取依据NEXTFLEX™ Rapid DNA-Seq Kit试剂盒的操作说明书完成。PE 文库构建及基因组测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.2.5　序列质控与组装　在测序实验中采用多个样品平行混合测序，各样品中的序列均引入了一段标示其样本来源信息的Index标签序列。根据Index序列区分各个样品的数据，提取出的数据以fastq格式保存。基于原始测序数据，使用相应软件对其进行数据质控，剪切掉数据中的低质量及含N的reads，获得后续分析需要的质量更好的序列。
1.2.6　基因预测与非冗余基因集构建　此次使用MetaGene对拼接结果中的contig进行ORF预测，并将核酸长度大于等于100 bp的基因翻译为氨基酸序列。用CD-HIT软件将所有样品预测出来的基因序列进行聚类，每个类取最长的基因作为代表序列，进行非冗余基因集的构建。使用SOA Paligner 软件分别将每个样品的高质量reads与非冗余基因集进行比对，统计基因在对应样品中的丰度信息。
1.2.7　α多样性、物种与功能注释及物种贡献度分析　数据使用美吉云平台的在线工具进行分析。使用DIAMOND软件将非冗余基因集与NR数据库进行比对，并通过NR库对应的分类学信息数据库获得物
种注释，然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度，并在各个分类学水平上统计物种在各个样品中的丰度，从而构建相应分类学水平上的丰度谱。分别利用Chao指数、Simpson指数
宋　雯等：地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵产香及菌演替的影响
香 韵
杂 气
和 Shannon 指数公式计算细菌生态多样性指数。使用 DIAMOND 将非冗余基因集序列与 KEGG 的基因数据库（GENES ）进行比对（E-value ≤10-5），根据 KO 、Pathway 、EC 、Module 对应的基因丰度总和计算该功能类别的丰度。然后基于样本的物种和功能的对应关系，进行物种与功能相对丰度之间的关联分析，出特定物种的功能贡献度以及特定功能的物种贡献度。
1.2.8　数据处理　测定数据为3组平行试验均值，采用SPSS 26和Excel 软件进行数据分析，并用Origin 2019b 软件绘图。
2　结果与分析
2.1　地衣芽胞杆菌对雪茄烟叶发酵过程挥发性香味成分的影响
雪茄烟叶香气物质总量在某种程度上决定了雪茄的呈香[23]。苯丙氨酸转化产物可以赋予烟叶花香特征，增加余味的醇净感[24]；类胡萝卜素降解产物可以降低烟叶刺激性[5]。西柏烷类降解产物具有清新的香气，可以增加烟气的醇和感[21]。美拉德反应产物可以对于赋予烟草坚果等香气，使其香韵更加多样化[25]。这些香气成分的含量与雪茄品质密切正相关[5]。地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵前后挥发性香气含量和感官质量评价的变化如图1所示。
发酵前烟叶中挥发性香气总量为398.2 μg/g ，发酵后，自然发酵组（对照组）和地衣芽孢杆菌组分别达到878.5和958.2 μg/g ，分别比发酵前提高了1.2倍、1.4倍。另外，地衣芽孢杆菌组也比对照组提高了9%。图1a 表明：发酵前烟叶中苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物和美拉德反应产物分别为8.3、45.3、21.2和9.1 μg/g 。发酵后自然发酵组分别为15.2、64.6、27.4和12.5 μg/g ，地衣芽孢杆菌组分别为20.7、 93.0、 30.5和14.7 μg/g ，与发酵前相比均有提高。与自然发酵组相比，地衣芽孢杆菌组4类挥发性香气成分依次提高了36%、44%、11%和18%。
雪茄发酵前后的感官质量评价。如图1b 所示：发酵前雪茄烟刺激性较强，杂气突出，香韵较弱且香气不够醇厚，烟叶整体的平衡感较差。发酵后，较自然发酵组而言，地衣芽孢杆菌组对烟叶杂气与刺激性降幅更大，香气醇厚感提升，余味更加醇净舒适，烟叶整体平衡感更加出。
综合以上研究内容可知，相较于自然发酵组，地衣芽孢杆菌组香气含量提升明显，内部化学成分协调，感官评价较好。
2.2　宏基因组测序与质控结果
Illumina 测序得到宏基因原始序列，如表1所示，
经质控、去宿主处理，两组样品每个平行分别得到
图1　雪茄烟叶挥发性香气含量（a ）和感官质量（b ）评价的变化
表1　宏基因组测序的质控及组装信息
样 本优化序列数重叠碱基总量（bp ）优化百分比（%）N50（bp ）
N90（bp ）
Max （bp ）Min （bp ）
CK_151 131 9307 706 404 92297.30553334112 023300CK_242 852 208  6 459 998 98897.0512******* 265300CK_344 531 094  6 713 929 19997.90648341113 619300BL_146 737 4347 043 566 45198.01526331309 379300BL_252 578 9047 913 762 12197.14502329309 379300BL_3
52 835 524
7 959 819 356
97.87
576
337
626 742
300
注：“CK ”表示自然发酵组，“BL ”表示地衣芽孢杆菌组，下同。
a
b
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES ）2023年8月reads 数约为 5 100万、4 300
万、4 500万、4 700万、5 300万、5 300 万条。对优化后序列拼接组装获得的 contigs 进行 ORF 预测，后基于ORF 预测基因进行聚类、构建。
N50（N90）：将各contigs 序列按长度大小排序，扫描各条序列的长度值并进行累加。当累加值第一次超过所有序列总长度的50%（90%）时，此时扫描到的序列，其长度值即为N50（N90）；相比序列
平均长度，N50（N90）更能准确表示此次序列拼接的效果[26]；组装结果显示，各组 N50 均大于 500 bp ，表明组装良好，可用于进行后续分析。
2.3　茄烟叶发酵宏基因组 NR 物种注释
NR 是非冗余蛋白质氨基酸序列库，将构建的
非冗余基因集与NR 数据库进行比对可以获得物种分类学信息。由图2的NR 注释结果来看，在域水平上，细菌的相对丰度高达 93.0%~97.9%，表明在
图2　不同处理发酵后菌域水平物种分布
高温快速发酵过程中细菌是烟叶发酵香气生成及其他的主要承担者。
α多样性指数可表示落物种组成的多样性，因此对2组的细菌进行了α多样性分析。Chao 是用chao1算法估计样本中物种总数。Simpson 也用来估算样本中微生物多样性，Simpson 指数值越大，落多样性越低。与Simpson 指数相反，Shannon 值越大，说明落多样性越高。自然发酵组和地衣芽孢杆菌组的细菌α多样性指数显著性差异如图3所示：从chao 指数来看，较自然发酵组而言，地衣芽孢杆菌组的chao 指数更大，表示地衣芽孢杆菌的物种总数更多，且2组的差异极显著。从simpson 和shannon 指数来看，地衣芽孢杆菌组的simpson
明显
图3　不同处理发酵后菌α多样性差异指数校验图小于自然发酵组，而shannon 指数明显大于自然发酵组，表示地衣芽孢杆菌组的落多样性更高。
在属水平上（图4），葡萄球菌属（Staphylococcus ）是发酵后烟叶表面唯一优势属，相对丰度占比高达91.7%。杨勇等[27]发现葡萄球菌属对腊肉中的培根风味形成有着重要影响。其次为烟草菌属（Nicotiana ），在自然发酵组和地衣芽孢杆菌组的相对丰度分别为1.2%和4.3%。
在种水平上（图5），尼泊尔葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis ）占比高达55.7%~67.2%，丰度大于0.5%的种几乎被葡萄球菌属和烟草菌属包揽，与属水平结果一致。但丰度大于0.5%的种中并未发现地衣芽胞杆菌，可能是地衣芽孢杆菌不可耐受雪茄发酵的最高温度，也可能是烟叶中存在未知的因素，不适宜地衣芽孢杆菌生长。
由图6可以看出，自然发酵组注释显示菌系中的微生物有1 295个属，地衣芽孢杆菌组注释显示菌系中的微生物有1 615个属。自然发酵组有255个特有菌属，而地衣芽孢杆菌组有575个独有属，增加了320个属，且增加的菌属均为地衣芽孢杆菌组的特有属。这说明：相较于自然发酵组，地衣芽孢
杆菌的添加提升了烟叶表面物种的丰富度。
2.4
　组间物种及差异分析
宋　雯等：地衣芽孢杆菌对雪茄烟叶发酵产香及菌演替的影响
图4　不同处理发酵后菌属水平物种分布
图5　不同处理发酵后菌种水平物种分布
对自然发酵组与地衣芽孢杆菌组发酵后烟叶表面菌进行差异分析，如图7a 所示：两组相对丰度
255  1 0401 295
1 0401 615807.5
1 615
830CK
2
1
BL
575
图6　不同处理发酵后菌属水平物种Venn 图
前15的菌属均存在显著差异。与自然发酵组相比，发酵后地衣芽孢杆菌组烟叶表面葡萄球菌属（Stap
hylococcus ）丰度占比有所下降，但依然远高于其他菌属；而烟草菌属（Nicotiana ）、假单胞菌属（Pseudomonas ）、链球菌属（Streptococcus ）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas ）丰度占比均有不同程度
的提升。再次说明在雪茄发酵过程中地衣芽孢杆菌的施加可以改变雪茄表面微生物落结构，增加菌丰富度。
自然发酵组与地衣芽孢杆菌组的雪茄表面物种功能进行差异分析，根据2组间物种功能丰度的差异，可以获得2组间的显著性差异功能（图7）。对2组发酵相对丰度前15的功能通路记进行分析，发
现：地衣芽孢杆菌的施加使得雪茄烟叶发酵中氨基酸的生物合成、碳代谢等代谢通路的相对丰度均有不同程度的提升，暗示菌可能增强了其代谢强度以维持自身生存，其中氨基酸的生物合成可能更有利于烟叶美拉德反应产物的合成[25]。氨糖与核糖的
代谢通路增强有利于细胞生长。