产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定
摘要：采用琼脂平板扩散实验，从湖南传统发酵腊肉和香肠中筛选出3株对单核增生李斯特菌（Listeria monocytogene54002）具有明显抑制作用的乳酸菌，排除酸和过氧化氢的干扰后，仍具有抑菌活性，而用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理以后，其抑菌活性消失，因此确定该抑菌物质为蛋白质类物质，即细菌素。三株菌所产细菌素具有一定热稳定性，在pH5～10之间仍具有一定的抑菌活性。通过生理生化实验和16S rRNA基因序列分析对3株菌进行了鉴定。PCR扩增得到1600bp左右的16S rRNA基因序列，将序列通过BLAST软件在NCBI网站上进行同源性对比，并通过MEGA5.0软件绘制系统发育树。结果显示3株菌的16S rRNA序列和数据库中的屎肠球菌的序列同源性均在99%以上，这与生理生化实验初步鉴定结果一致。
关键词：细菌素，筛选，屎肠球菌
Identification and screenging of bacteriocin-producing lactic acid bacteria
Abstract：Three lactic acid bacterium were isolated from Hunan traditonal fermented meats，which exhibited
strong inhibitory activity against Listeria monocytogenes 54002. After eliminating the interference factors such
as the organic acids，hydrogen peroxides，the inhibitory activity still existed. But inhibitory activity was lost after
treatment with trypsin and pepsin. Therefore，the inhibiotory substance could be classed as bacteriocin. The
bacteriocin exhibited good thermal stability and its active pH range from 5~10. The three bacteriocin-producing
bacteria were identified on the base of physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene
sequence. The sequence fragments around 1600bp 16S ribosomal RNA were amplified from total DNA of the
three isolated strains by PCR. The sequence was completed by the application of BLAST on the websites of
NCBI and phylogenetic tree was drawn with MEGA5.0. According to the high homology of 16S rRNA sequence，
the three bacteriocin-producing bacteria was identified as Enterococcus faecium. Key words：bacteriocin；screening；Enterococcus faecium
细菌素是由某些细菌产生的一类抑菌物质，是
由细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一
类多肽类物质
[1]
。细菌素的抑菌范围一般包括一些亲
缘关系相近的细菌，而产生菌对其细菌素具有自身
免疫性
。目前研究最为深入的细菌素是乳酸链球菌
肽（
Nisin），又称乳酸链球菌素，是由乳酸链球菌产生
的一种多肽，它于
1969
年得到
FAO
和
WHO
的认可，是
唯一允许作为防腐剂在食品中使用的细菌素，虽然
细菌素已被许多国家允许作为食品添加剂放入食品中，但是也存在很大的缺陷，比如抑菌谱较窄，抑菌活性在碱性条件下不稳定
[2]
等，寻高产细菌素以及
更稳定的细菌素成为研究的热点。作为细菌素的主
要产生菌，乳酸菌生境广泛，数量众多。近年来，国内外学者为获得结构新颖
、抑菌活性更为稳定的细菌
素，广泛地从当地传统的发酵食品中，尤其是发酵肉制品中进行产细菌素乳酸菌的分离筛选
。
如
de
Carvalho从意大利salami香肠中
[3]
分离到一株能抑制
李斯特氏菌的乳酸菌，
Noonpakdee
[4]
从泰国传统发酵
香肠
nham 中分离到一株产 Nisin 的乳酸乳球菌；
Martinis
[5]
从巴西传统发酵肉制品中共分离得到三株
产细菌素乳酸菌，抑菌结果显示，三株菌都具有较强的抑制李斯特氏菌能力；Todorov
[6]
从葡萄牙传统发酵
猪肉制品中分离到两株产细菌素的植物乳杆菌，而
212生物工程
2013年第20期
Vol . 34 , No . 20 , 2013
菌株发酵原液调
pH
调
pH+
过氧化氢酶
TRS5 13.1 13.0 12.7
TRS6 12.7 10.7 10.5
HY07 13.7 12.7 11.6
表
1
筛选菌株的抑菌作用（
mm
）
Table 1 Inhibitory activity of the three isolated strains（mm）我国学者则多从四川腊肉香肠
[7]
、
宣威火腿
[8]
、
泡bacterium
菜
[9-11]
、
传统乳制品
[12-13]
等发酵食品中分离得到产细
菌素的乳酸菌。
本研究旨在从我省传统的自然发酵肉制品中
（如腊肉、香肠）分离筛选产细菌素的乳酸菌菌株，对
充分挖掘本地传统发酵食品中的乳酸菌资源具有一
定的理论和实践意义
。
本文报道了来源于发酵肉制
品中的三株产细菌素的乳酸菌-屎肠球菌的分离和
鉴定结果
。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
腊肉
、香肠市售；单增李斯特菌54002、大肠杆
菌
、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌为本实验室保
藏菌种；MRS培养基胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、
酵母浸粉
5.0g、柠檬酸三铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80
1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾
2.0g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、琼脂15.0g、水1L、pH=6.0～7.0；BHI培养基胰蛋白胨
17.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉6.0g、氯化钠5.0g、
磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂7.5g、水1L。
DNP-9272BS-Ⅲ型生化培养箱上海新苗医疗
器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面净化工
作台苏州净化设备有限公司；普光HH-8型数显恒
温水浴锅上海浦东物理光学仪器厂；LDZX-50FBS
型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；
TGL-20M型离心机长沙英泰仪器有限公司；雷磁
pHs-3C型pH计上海精科。
1.2 实验方法
1.2.1 初筛
1.2.1.1 单核增生李斯特菌菌液制备将活化过夜
的单增李斯特菌按2%接种至BHI培养基中，37℃培
养至稳定期，备用
。
1.2.1.2 产细菌素乳酸菌的初筛将市售的湖南传
统发酵肉制品称取25g，切碎放置于225mL无菌生理
盐水中，摇匀，制备系列稀释溶液，选取合适稀释度
的稀释液，移取0.1mL涂布于MRS固体平皿中，培养
（24±2）h。将单增李斯特菌菌液0.1mL与100mL溶化
后并保持在50℃左右的BHI半固体培养基进行混合，
混匀后轻轻倒在长有乳酸菌菌落的MRS培养基上
层，待培养基凝固后将平板继续培养
20h，选取有抑
菌圈的菌株，进行菌落的挑取，在MRS培养基平板上
划线纯化、保存。
1.2.2 复筛
1.2.2.1 琼脂扩散法参考O’Connor和岳喜庆的
方法
[14-15]
。
将单核增生李斯特菌菌液
0.1mL
与
100mL
溶化
后并保持在
50℃
左右的
BHI
固体培养基进行混合，倾
注平板，待培养基凝固后轻轻放置无菌牛津杯，在牛津杯中加入
0.2mL乳酸菌培养液，37℃培养12h，观察
抑菌圈大小，用测量尺测量抑菌圈直径
。
1.2.2.2 有机酸的排除将纯化后的菌株在液体MRS培养基中培养24h，用1mol/L NaOH将培养液的pH
调至
6.00～6.50
，
1000g 10min
离心，取上清液，采用
琼脂扩散法观察能否产生抑菌圈
。
1.2.2.3
排除过氧化氢的干扰参考姚丽娅的方法
[16]
。
将过氧化氢酶溶解于
50mmol/L
的磷酸盐缓冲液
（
pH=7
）中，将过氧化氢酶加入以调
pH
至
7
左右的发
酵上清液当中，使终浓度为
50mg/L
，在
37℃
水浴锅中
温浴
2h
，然后用琼脂扩散法观察加入过氧化氢酶后
有无抑菌圈出现。
1.2.3
抑菌物质的初步鉴定将胃蛋白酶和胰蛋白
酶分别溶解于
pH=3和pH=6磷酸盐缓冲液中，加入已