2021年34卷1期Vol. 34
No. 1
西"农业学&
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
40
文章编号：1001 -4829(2021)1 -0040 -05DOI ： 10. 16213/j. cnkl. scjas. 2021. 1.005
烟叶成熟过程中活性氧的变化
范宁波S 杨 洋2，鄢 敏2，李林秋2，严 素2，易 蔓2，杨懿德2
(1.河南农业大学烟草学院，河南郑州450002；2.四川省烟草公司宜宾市公司，四川宜宾644000)
摘要：！目的】为明确烟草&Nicotiana tabacum L.)在不同的成熟阶段中活性氧(ROS )的积累。【方法】采用氯化硝基四+ V 蓝
(NBT )化学组织染法来进行组织染，并利用#44度法分别测定未熟、适熟和过熟阶段烟叶的过氧化氢(H2O2)、超氧阴离
子(0+ -)和丙二醛(MDA '含量，并利用实时荧4定量PCR ( qRT-PCR )法测定了相关基因的相对表达量。【结果】叶片经NBT 染 后，随着叶片成熟度的増加，叶片上的蓝斑増加。叶片内的0+ -和H 2O 2 % MDA 的含量随成熟度的増加逐渐上升，且皆在过 熟阶段达到最大值。伴随着成熟度的増加,NtPSAl 的相对表达量逐渐降低，而CYP82E 的表达量却呈逐渐増加的趋势$【结论"烟
叶随着自身成熟度的増加，叶片组织内的活性氧物质逐渐积累，对烟叶造成了一定的伤害$ 关键词：成熟度；烟草；活性氧中图分类号:S572
文献标识码:A
Changes of Reactive Oxygen Species in Tobacco Leaf During Maturing
FAN Ning-bo 1 % YANG Yang 2 % MIN Min 2 % LI Lin-qiu 2 % YAN Su 2 % YI Man 2 % YANG Yi-dc 2 !
(1 - Colleac of Tobacco , Henan Agricultural University , Henan Zhengzhou 450002, China ； 2- Yibin City Company of Sichuan Tobacco Com
pany % Sichuan Yibin 644000 % China )
Abstraci :【Objeclve 】 In order to investigate the accumulation of reactive oxycen species (ROS ) in tobacco (Nicotiana tabacum L. ) at dif
reactive oxygen species (ros)ferent maturity stages.【Method 】The tissue staining was performed by ngrotetrazolium chloride ( NBT ) chemical tissue staining method- And superoxide anion ( O 2 - ) , hydrogen peroxiCe ( H 2O 2 ) , malondialdehyde ( MDA ) content were measured in leaves with different maturity ,
respectively. The relative expression of related genes was determined by real-time quantitive PCR ( qRT-PCR )-【Result 】The results
showed that after the leaves were dyed with NBT , as the maturity of the leaves increased , the blue spots on the leaves increased- The content of H 2O 2 , O 2 - and MDA in the blades also increased with the increase of maturity and reached the miirnum in overripe tobacco- With the increase of maturity , the relative expression of NtPSAl graduaOy decreased , while the expression of CCY82E showed a graduaOy increasing
trend.【Conclusion ] With the increase of maturif of tobacco leaves , reactive oxycen species in /o O tissue graduaOy accumulated , which
caused certain damage to tobacco leaves -Key words ：Maturity stage ； Tobacco ; Reactive oxycen species (ROS)
【研究意义］氧气是地球上绝大多数生物维持
生命活动的必需物质之一，但是在生物利用氧气的 过程中，会附带产生活性氧物质等副产物。活性氧 主要包括超氧阴离子(01-)、氢氧根离子(OH -)、
轻自由基(• OH )、过氧化氢(比。2)、单线性氧
收稿日期：2020 -10 -12
基金项目：四川省烟草公司宜宾市公司资助项目(2019511500 20107)
作者简介：范宁波(1995 -)，女，河南登封人，在读硕士研究生，
研究方向烟草调制与加工，E-mail ： 136****2806@ 163- com ； * 为通讯作者：杨懿德(1975 -)男，湖南邵阳人，农艺师，硕士，主 要从事烟叶生产技术研究与推广工作，E-mail #757364325 @qq-com,
(1o i )等［1］&高浓度的活性氧会对生物产生一些害 处，导致生物体的氧化损伤并诱导细胞死亡*2+，甚
至导致基因的突变［3］&【前人研究进展］张盛春等
认为植物叶片的衰老是程序性细胞死亡的一种，能 够引起植物体内的代谢紊乱并最终导致植物器官或 整株死亡⑷。自由基学说认为，活性氧伤害是引起 植物叶片衰老的原因之一⑸，线粒体和叶绿体*6-7］ 是植物当中产生活性氧物质的重要来源&活性氧的
积累导致细胞膜的过氧化，使丙二醛(MDA )等有毒 物质积累增加，导致细胞死亡。王宁等研究发现，强
氧化性的产物具有极高的活性和毒性，会引起一些
大分子物质(如脂质、蛋白质和DNA 等)的氧化破
1期范宁波等：烟叶成熟过程中活性氧的变化41
坏，甚至引起细胞的死亡目前关于活性氧的研究当中，除了一些经典的生理指标外,NBT组织化学染法由于具有直观、方便的优点，在科学研究中的应用也逐渐变得广泛。谭冬梅通过NBT染法探究了干旱
胁迫对新疆野苹果及平邑甜茶的影响⑼；郭丹等人通过组织化学染法直观地为表现出褐斑基因对水稻的影响［10］；聂亚锋等人利用化学染法表明了真菌对空心莲子草的影响［11］&目前NBT组织染法在其他植物上应用得比较多，然而在烟叶中的应用尚未见诸报导。【本研究切入点】烟叶在逐渐成熟、衰老的过程中，由于光合和呼吸作用等生理过程，会产生大量的活性氧物质&为了明确烟草叶片在成熟过程中活性氧物质的积累，本研究选取了不同成熟度（未熟、适熟、过熟）的烟叶，【拟解决的关键问题】通过化学染法、一些活性氧物质和一些衰老相关基因的测定，探讨了烟叶在成熟、衰老过程中的活性氧物质的积累过程。
1材料与方法
1-1实验材料
本实验于2018年9月在河南省洛宁市取样，实验材料为豫烟6号、豫烟10号和K326三个品种的烟叶，并于河南农业大学进行相关实验。选择地块平整、肥力中等的烟田，前茬作物为小麦。试验地土壤为黄棕壤，施用肥料为烟草专用复合肥,m（N）:m （P2O5）:m（KO）=1：1：2&分别采收成熟度不同的豫烟6号、豫烟10号和K326的中部叶（自上而下第10~12位叶），一部分烟叶在田间立即取样用于NBT染，另一部分烟叶放入干冰中及时带回实验室，并置于液氮中及时妥善保存。
1.20.1%NBT染
组织化学染法可以方便快速地表征活性氧积累的程度和部位，我们参照并改进谭冬梅的方法，使用NBT（氮蓝四卩坐）染法来表征烟叶中ROS的积累叫
选取不同成熟度的叶片，用直径为10mm的打孔器在叶片中部取样（注意不要取到叶脉），将样品放入盛有0.1%NBT的10mL离心管中，避光染6h后取出。然后将染后的叶片用75%的酒精脱，直至叶绿素完全_¥以便于观察，使用体视显微镜（Olympus SZX16）观察并拍摄染的叶片组织。
1-3比。2、0厂和MDA的含量测定
使用苏州科铭生物科技有限公司生产的试剂盒，按照其说明书中的方法检测H2O2和0厂含量；参照闫晶等人的方法使用硫代酸法测定叶片中MDA的含量
*12+&1.4qRT-BCR分析
在田间取样之后，用锡箔纸保存，并放置于干冰中妥善带回实验室进行相关基因的检测。参考潘飞龙等人的方法使用qRT-BCR法测定活性氧相关基因的相对表达量［13］&从NCBI网站核酸数据库中检索烟草成熟衰老相关基因，并以烟草核糖体蛋白基因L25作为内参基因［14］。利用DNAMAN软件设计引物，引物序列列表见表1&采用实时荧光定量PCR（qRT-BCR）法检测基因的相对表达量，每个处理设置3次生物学重复&循环条件：在95C预变性10mV,95C变性10S，在60C退火及延伸30s,—共进行40次循环&按照颜彦等人的方法采用2-皿［15］算法对试验结果进行分析。
1-5仪器
PCR仪（ABI9700"、荧光定量PCR仪（Rocha LC480"、打孔器、离心机（Thermg MVro21R）、紫外分光光度计（美普达UV-1600紫外可见分光光度计）&
1-数据处理
试验数据采用Excel2010进行整理并使用SPSS22.0进行单因素方差分析（LSD），利用OVV v 2018进行图形的绘制。
2结果与分析
2.1不同成熟度烟草叶片细胞的NBT染结果
组织化学氮蓝四卩坐（NBT）染法经常用来检测植物组织中0厂的积累
*16+,—般颜越浅，表明该植株的抗氧化能力越强，可以方便快速地表示植物所受到的胁迫，颜较深则表明植物组织中活性氧的积累较多。NBT染显示，未熟时叶片上仅有少许蓝颜料沉淀，适熟时颜颜料的覆盖面积增加，在烟叶呈过熟状态时，蓝的颜料几乎要覆盖整个叶面。随着烟叶成熟度的增加，染斑面积逐渐增大，初步表明细胞膜的氧化程度增加（图1）&
2.2不同成熟度条件下活性氧物质含量的差异
由图2可知，日2。2和O；-含量也是随着烟叶
表1烟草叶片衰老相关基因qRT-PCR引物序列
Table1Sequence list of qRT-BCR primers for tobacco lecO senes-cence-eeeaied genes
基因名称登录号引物序列
Gene name Gene IU Pecmeesequence
L25L18908.1
F:CCCCTCACCACAGAGTCTGC
R:AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT CYP82E4KC120817.1
F:CACTTCAATGACGACGGC
R:ATTTGT CA GCT A AGTCTCCGA NtPSAl Y16644
F:CGGAATTACCTCTATTGGCG
R:AAGTGGGATACACTGGTCT
42西"# 业学&34卷
未熟 适熟 过熟
4U 3U 00
<
(兰0£土)*如
V C I E
图1不同成熟度烟叶的NBT 染结果
Fig. 1 NBT staining results at dmerent maturity of tobacco leaves
熟度的 而逐渐 ， 同的 差异
显著，在烟叶的成熟
，比。2和0厂的含
现为豫烟10号〉豫烟6号〉K326&结果还, 烟6 ，比。2的 变 现为：适熟烟叶比未熟烟叶 了 0. 33倍，过熟时期比未熟时
期增加了 1-07倍；豫烟10 熟 ，适熟烟
叶比。2含量比未熟烟叶增加了 0. 44倍，过熟时期
比未熟时期增加了 1-19倍；而K326 H 2O 2的 适
熟和过熟期分别增加了 0.52和1.31倍。而对于
；-
变化，相较于未熟烟叶，豫烟6 适熟期和
熟期0；
-的 分别增加了 0.84 2.80倍；豫
烟 10 分别 了 0.59 2.35 倍; 而 K326 的 0
；
-
分别 了 0.74 2.97倍。图2的结果
1的NBT 染结果基本一致， 现为未熟时
期的叶片中活性氧物
最低，适熟时期较高，过
熟时期 最高。
2- 3不同成熟度对烟叶中MDA 含量的影响
MDA 是 脂 的最终产物，结果显
示，成熟
MDA 的 速 ，
同品
存在着一定的差异。MDA 的
现为豫烟
10
图3不同成熟度烟叶中MDA 含量的变化
Fig. 3 MDA content of tobacco leaves at different maturity
10号〉豫烟6号〉K326，且豫烟10号的MDA 的含
量均显著高于其他2个品种（Y <0.05 ）。豫烟10
适熟期MDA 的 比未熟时期 了 2- 02倍,
熟时期MDA 的 相 未熟时期
了 5.20倍；豫烟6号的烟叶在适熟时期MDA 的 比未熟
时期 了 1.79 倍， 熟时比 未熟时
了 4.
59倍；随着烟叶的成熟衰老,K326烟叶适熟时MDA
含量增加了 2.25倍，过熟时比起未熟时增加了 6.
41倍。这
烟叶成熟衰
，随着脂的
,
的有毒物质也
速增加，且烟叶成熟之
后 的 度要远高于烟叶成熟之前（图3）&
2.4 烟草叶片成熟度对NtPSAl 和CYY82E4相对
表达量的影响
研究发现,NtPSAl 基因和CYY82E4基因在植
物组织不同的发育阶 的表达量存在差异，因此以 征烟草叶片的衰 [17-18]&烟6号,10
K326 3
进行qRT-PCR 分析,
以NtL25基因为内参基因，并以 烟6号未熟时期
■ 6号
—i 豫烟10号
一 K326
6
4
2
4U2U0。
O Z H (M o m i )
*<rn o E
*
**
未熟
适熟 过熟
成熟度
Maturity
^
8
4
4U.3U0F
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Q
寻)*如；0
成熟度
Maturity
图2不同成熟度烟叶中H 2O 2和O 2 -含量的变化
Fig. 2 H2 O2 and O2 - content of tobacco leaves at dzerent
maturity
1期范宁波等：烟叶成熟过程中活性氧的变化43
豫烟10号
0 8 6 4 2 0
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豫烟6号未熟
适熟 过熟成熟度
Maturity
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未熟 适熟 过熟
成熟度
Maturity
烟草叶 熟度对基因NtPSAl 和CYP82E4表达量的影响
Effect of tobacco /cO maturity on the expression of NtPSAl and CYY82E4
图4
Fig.4
的烟叶作为
，计算这3 的烟叶 同的
成熟度情况下,NtPSAl 和CYY82E4基因的相对表
达量&结果显示，随着叶片成熟、衰老程度的 ，
NtPSAl 的相对表达量逐渐降低，而CYY82E4基因
相
达量却呈逐渐
的趋势（图4 "。在未熟时
期,3 烟叶 的基因表达
显著差异，在适
熟期
熟期，基因的相
达量逐渐开始呈现显
著差异。
3讨论
NBT 染可以方便直观地用于检测叶片中活
性氧的产生情况，烟叶 熟、衰的 也常常
产生
的活性氧，因此我们可以用此方法方
断烟叶的成熟度。本研究 NBT 染法
同成熟度的烟草叶片进行染，结果显示豫烟
6 、烟10
K326烟叶在未熟阶段时，叶片上
的蓝
较少，但是着生长发育的进行，在适
熟阶段时烟叶上 显的染 出现，随着时间
的 ，到叶片的生长后期 熟衰老阶段时，其染
更大，蓝
要 整个烟叶样品&
我们的染结果初步、浅显
了随着烟叶成熟
度的 ，叶片中的活性氧物质是逐渐 的&
MDA 是
的最终物质，对生物体具有很
的破坏作用，因此可以 脂
的程度&研究结果 ，MDA 的 着烟叶成熟衰老
的进程逐渐
，且从适熟到过熟的
未
熟到适熟这段时期的增加量&比。2和0；-的变化
也基本与MDA 保持一致， 熟阶 脂 ：
作用显著，造
透性 ， 了叶片的损，这 了烤烟 熟 ，其脂 会加，与人所报导的基本一致[19-20]& 而植物
迫时，进化出了一定的抗逆能力&当植物体内 了活性氧等有毒物质时，植物体内会产生一系
除活性氧的机制，其研究最为广泛的即为抗
体系[21_22]， 物（POD ），多
氧化酶（PPO ），氧化氢酶（CAT ），超氧化物歧化酶 （SOD ）等[23]O 烟叶的成熟度不够时，烟叶主要处
物 时期，整株烟株的物质代谢迅速，叶片中
抗
的活性较高，能够及时、迅速
除植物细
内的有毒物质，此时
活性氧物质难以
& 而，
着叶片的逐步衰老， 逐渐
亡，抗
活性下降，导致了活性氧物
，
打破了其与抗 体系 的动态平衡，进而对叶片 造 害，导致叶片 亡[11]，这 :
是出现本文结果的原因&本文研究
,3 4
的烟叶 ，其活性 物 的 也 显著差
异，是同 的烟 其自身的差异，导致
烟叶自身的活性氧的清除 也有所一定的区别&
NtPSAl 编码26S 蛋白酶体的非催化型亚基，其
生长旺盛的组织 达量较高，而衰老的叶片组织中表达量较低[17] & CYY82E4编码P450蛋白,
有研究，基因 叶片的衰老，其表达量逐渐
[18]，本文的研究结果也 ，随着烟叶成熟度 的 ，NPYSAl 的相 达 逐步 而 CYY82E4
的表达量逐步降低，这与前人的报导基本一致&
4结论
本研究探讨了烟草叶片在不同的成熟度时期活
性氧的代谢，通 学染、生指标、基因测定等
方法鉴定了烟叶中活性氧物质的 &结果 ，
着烟叶成熟度的 ，NBT 染程度逐渐增
，活性氧物质逐步，衰相关的基因其表达量 也发生了显著的变化&本文中所应用的NBT 化学
染法，可以方 烟叶中活性氧物质的
44西"#业学&34卷
积累，可以作为衡量烟草成熟度的参考指标。
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(责任编辑全津莹)
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