真菌(1-3-β-D葡聚糖测定规范操作
1.目的
  建立真菌(1-3-β-D葡聚糖检测标准操作规范,保证实验结果的准确性。
2.授权操作人
经培训合格的微生物实验室检验人员。
3.实验原理
1-3-β-D葡聚糖检测原理:真菌(1-3-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白, 根据其所引起的浊度变化对真菌(1-3-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。
4.产品性能指标
4.1  灵敏度    10pg/ml
4.2  精密度      批间  CV≤10%
4.3  准确性     回收率75-125%
4.4  标准曲线相关系数 r绝对值0.980 
5.实验组成
5.1实验仪器及器具: 
MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪, 20~200µl加样器、100~1000µl加样器、旋涡混合器、定时器。
5.2实验耗材:
200µl无热原吸头、1000µl无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。
5.3试剂盒组成
真菌(1-3-β-D 葡聚糖检测试剂盒(光度法):
试剂盒包括反应主剂和样品处理液。
6.工作环境
  相对湿度:20%~80%
温度控制:10~30℃;
电源电压:220V±10%50Hz±2%
7.标本采集及保存
7. 1检测样本:
血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等。
7.2采集要求:
采样过程要求无菌操作,用专用的无热原真空采血管(肝素类抗凝)。
常规病人早上用药前采血/取样(血透患者透析前采血)。
7.3样本保存:
样本采集后应在3000/分进行离心,若不能及时检测,应将血浆转移至无热原转移管内,在-20℃冰箱中冷冻保存,一周内使用。
8.操作程序
8.1 打开MB-80微生物快速动态检测系统主机、电脑及恒温仪预热30min
8.2 打开MB-80微生物快速动态检测系统软件,录入病人信息、样本种类及检测项目等信息后点击采集。
8.3 血液前处理过程,无菌操作,用专用无热原真空采血管(肝素类抗凝)抽取静脉血4ml轻轻混匀,按转速3000r/min进行离心1分钟,得到富含血小板血浆。
8.4 取上述富含血小板血浆100µl,加入到样品处理液中,轻轻摇匀10秒后插入恒温仪加热区中进行70℃干热10min
8.5干热结束后,将前处理液冷却5min,至室温后取出(取出时切忌震荡)。
8.6 取上述前处理液中上清液200µl加入到反应主剂中,轻轻混匀(一般混匀10秒即可),待
完全溶解至透明后,全部移液至平底试管中(不要产生气泡),立即插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行检测。
8.7 反应结束后仪器自动计算结果并保存。
待测血浆样品制备、检测示意图
9.操作注意事项
9.1预热采集
在进行试验之前,仪器一定要提前预热30min,达到工作温度后,按要求填写表头信息,完毕后点击采集,使仪器处于采集状态后再进行试验。
9.2 样本预处理
9.2.1 血液标本3000r/min离心1min
9.2.2 取富含血小板血浆(离心后上层清液的中部)。
9.2.3 70℃加热时间严格控制在10min
9.2.4 样本处理液加热冷却后,不要震荡以免将处理过的下层干扰物质悬浮上来。
9.2.5 取处理液的上清液。
9.2.6 加入主剂的200µl液体要全部转移至平底试管,转移过程中不能出现气泡。
9.2.7 平底试管要一次插到底,插入后不要再碰触。
10.结果判断与分析
    检测值﹤10pg/ml,阴性。
检测值介于1020pg/ml之间,临床观察期,建议动态采血检测。
检测值﹥20pg/ml,阳性,建议再次采血以确诊。
11.实验解释
本实验结果仅对本标本负责,提供给临床参考,请结合其他诊断方法和临床表现做综合诊断。
12. 特殊标本处理
对一般黄疸、溶血、乳糜血标本,稀释2-5倍后进行检测。稀释步骤为:取100µl血浆标本加入到前处理液中,经过70℃干热并冷却后,再取225µl上述经处理后的标本加入到另外的一
900µl前处理液中,即得稀释5倍的待测标本(如需其他稀释倍数则按相应的比例进行),然后取200µl加入到反应主剂,溶解后全部转移至平底试管中插入仪器进行检测,注意需在检测软件中稀释倍数一栏填上稀释倍数,仪器会自动按照相应的稀释倍数计算结果。
备注:对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本,应重新采血。
13.干扰因素
13.1产生的假阳性的原因有:应用纤维膜进行血液透析患者、某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖、某些品牌的静脉制剂(白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等)含有葡聚糖、某些细菌败血病患者(尤其是链球菌败血症)。
13.2特殊真菌如接合菌(毛霉菌、根霉菌)细胞壁没有1-3-β-D 葡聚糖成分,隐球菌细胞壁外有荚膜致使(1-3-β-D 葡聚糖释放不出,这些真菌无法检测到。
14.质量控制
  标本进行测定时应同时进行标准曲线的制作,目的是测定真菌(1-3)-β-D葡聚糖的测试性能及验证检测结果的准确性能。(标准曲线的制作见标准曲线制作规范操作文件)
15.维护保养
    15.1 仪器保养 注意防尘、防水、防污染、防止异物进入试管孔内;定期做好系统的表面清洁。
    15.2 软件维护 本系统的计算机应只供本系统使用,对外来的一切软件、数据文件在使用前一定要先查杀病毒,避免造成日常记录文件的损坏或丢失。
    15.3 三个月使用检测软件中的[系统自检]功能,确保仪器工作正常。
16.安全防护措施
      16. 1 试剂盒应2~8℃避光保存,使用前应检查有效期。若过期或出现破损禁止使用,以免影响测定结果。
      16.2 试剂盒为体外诊断试剂,其中的成分可能会导致皮肤和眼睛疼痛,也可刺激黏膜和上呼吸道,所以应避免与皮肤接触,避免吸入和食入,禁止使用于人体。
   16.3 3 d实验操作中避免微生物及细菌污染
17.标本处理
已检验过的标本作高压灭菌后由专门人员统一处理
18. 异常结果处理
    本实验结果异常需与临床诊断相符合,不符合的结果应及时复查或与临床联系
19.应急处理
    若出现不能自行解决故障,应及时联系经销商或工程师处理,并告知微生物实验室负责人。
20. 参考文献
① 张秀珍,朱德妹主编.临床微生物知识检验问与答.人民卫生出版社.第一版.2008
② 周庭银,倪语星主编.临床微生物检验标准化操作.上海科学技术出版社.第一版.2009
③ MB-80微生物快速动态监测系统配套使用说明书
④ 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的指南