谷胱甘肽S-转移酶P1蛋白在肺癌中的表达及临床病理学意义
陈传萍;何;潘忠诚;吴广平;赵雨杰
【摘 要】目的 探讨肺癌中谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)表达水平及临床病理学意义.方法 应用免疫组织化学方法检测50例原发性肺腺癌、20例癌旁正常组织、11例肺转移性腺癌和14例肺鳞癌组织石蜡标本GSTP1蛋白表达水平,观察其与肺癌患者临床病理学参数的关系.采用Western blot检测8例新鲜肺腺癌、鳞癌及癌旁组织中GSTP1蛋白表达水平.结果 GSTP1在32例原发性肺腺癌及9例肺鳞癌组织中呈高表达,明显高于癌旁正常组织表达水平(x2=6.665,P=0.010; x2=3.927,P=0.048),但在原发性肺腺癌、肺鳞癌及肺转移性腺癌中表达无明显差异(P＞0.05).GSTP1表达与肺腺癌患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及淋巴结转移无明显相关性(P＞0.05),但与肺腺癌患者预后呈负相关(x2=4.171,P=0.041).Western blot证实GSTP1在肺腺癌及鳞癌中表达明显高于癌旁组织(t =2.545,P=0.023；t =2.337,P=0.035).结论 GSTP1在肺癌中表达上调,并与肺腺癌患者预后相关.%Objective To study the clinicopathological significance of the expression of GSTP1 protein in lung cancer. Methods The expression of GSTP1 protein was detected by immunohistochemistry in 50 cases of prim
ary lung adenocarcinoma specimens, 20 adjacent non-cancerous lung tissues, 11 metastatic pulmonary adenocarcinoma and 14 squamous cell carcinoma tissues. Western blot was used to examine the GSTP1 protein level in 8 cases of lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and adjuvant non-cancerous tissues. The relationship between the protein expression and clinicopathological features was analyzed. Results Overexpression of GSTP1 protein was shown in 32 and 9 cases of lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma tissues, respectively, which were much higher than that in adjuvant non-cancerous lung tissues (χ2=6.655,P =0.010;χ2=3.927,P =0.048),but there was no statistically significant difference of GSTP1 expression between primary lung adenocarcinoma, metastatic pulmonary adenocarcinoma and squamous cell carcinoma tissues (P > 0.05). The expression of GSTP1 protein was not correlated with age, sex, tumor size, differentiation or lymph node metastasis (P > 0.05), but had a negative association with the prognosis of the lung adenocarcinoma patients (χ2=4.171 ,P =0.041). The expression of GSTP1 protein was higher in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma tissues than that in non-cancerous lung tissues detected by Western blot (t =2.5
45, P = 0.023 ;t =2.337 ,P =0.035). Conclusion GSTP1 is up-regulated in lung cancer and positively correlated with the prognosis of the lung adenocarcinoma patients.
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2013(042)001
【总页数】5页(P69-72,76)
【关键词】谷胱甘肽S-转移酶P1;肺腺癌;肺鳞癌;预后
【作 者】陈传萍;何;潘忠诚;吴广平;赵雨杰
【作者单位】中国医科大学生物芯片中心,卫生部细胞生物学重点实验室,沈阳110001
【正文语种】中 文
【中图分类】R734.2
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，5年存活率约为10%～15%，已成为我国恶性肿瘤死亡原因
的第一位［1］。目前对肺癌尚缺乏有效的早期诊断和手段，深入研究与肺癌发病机制相关的因子对提高肺癌的诊断率、早期发现肿瘤复发和转移、监测疗效以及判断预后具有重要的意义。谷胱甘肽S-转移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）是谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）家族的重要成员。研究发现，GSTP1在喉癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、前列腺癌及卵巢癌等多种肿瘤组织中表达异常［2～11］，提示它与肿瘤的发生发展密切相关。GSTP1是肺脏重要的解毒酶，它在肺癌中的表达情况尚不清楚。本研究拟应用免疫组织化学和Western blot技术检测GSTP1在肺癌组织中的表达，旨在探讨其临床病理学意义。
1 材料与方法
1.1 材料
收集2006年1月至2011年12月中国医科大学附属第一医院具有完整临床资料的原发性肺腺癌手术切除标本50例，其中35例有完整随访资料。癌旁正常肺组织20例，肺转移性腺癌11例，肺鳞癌14例。此外有8例肺腺癌、鳞癌及癌旁正常组织，取样后立即置液氮中冷冻保存。
GSTP1羊抗鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司（sc-66000）；SP法免疫组织化学试剂盒、DAB显液购自福州迈新公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、上样缓冲液、BCA定量及ECL发光试剂盒均购自上海碧云天生物公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学SP法：标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚度切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。3%过氧化氢室温15 min去除内源性过氧化酶。PBS清洗后，置于柠檬酸缓冲液（pH6.0）121℃高压热抗原修复1 min，至自然冷却，PBS清洗。滴加山羊血清，室温封闭20 min。滴加一抗GSTP1（1︰500），4℃孵育过夜。次日室温放置30 min后，PBS清洗，滴加鼠二抗，37℃10 min。PBS清洗，滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，37℃10 min。DAB显，苏木素复染，盐酸乙醇分化后常规脱水，透明，封片后于光学显微镜下观察结果。参照文献［12］评分方法制定染判断标准。每张切片400倍显微镜下随机选取5个视野，每个视野记数100个细胞，计算5个视野的阳性细胞的平均百分数，分为4级：1%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分；染强度：无着0分，浅黄1分，黄或深黄2分，褐或棕褐3分。上述2项相乘为分级标准：≥4分定义为高表达。
多态性的作用1.2.2 Western blot：称取50 mg冷冻保存的癌及癌旁正常组织，加入300 μL裂解液和4 μL蛋白酶抑制剂，冰上超声裂解组织5 s，重复4次。静置30 min后，12000 r/min 4℃离心10 min，收集上清-70℃保存。测定蛋白浓度，样品均定量为5 μg/μL，每泳道上样50 μg蛋白，SDS-PAGE 电泳，60 V 70 min电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（GSTP11︰500，GAPDH1︰1000）。4℃孵育过夜。TBST洗膜后，1︰5000羊抗鼠二抗室温孵育1.5 h，TBST清洗，ECL发光并以凝胶显像仪（MF-chemibis3.2 DNR，以列）显像。运用quantity one软件，根据ECL发光成像后条带和电泳条带的面积和密度计算每个条带的灰度值。
1.3 统计学分析
采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。免疫组化检测癌与癌旁组织蛋白表达差异及GSTP1蛋白表达水平与患者临床病理学参数的关系采用χ2检验。Western blot检测GSTP1蛋白表达差异采用独立样本t检验。Kaplan-Meier计算累积生存率，Log-rank进行生存时间差异检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GSTP1蛋白在肺癌组织中的表达
GSTP1在肺癌中呈胞核及胞质表达，在50例原发性肺腺癌及14例肺鳞癌组织中分别有32及9例呈高表达，明显高于癌旁正常组织表达水平（χ2=6.665，P=0.010；χ2=3.927，P=0.048）（图1，表1）。但GSTP1在原发性肺腺癌、肺鳞癌及肺转移性腺癌中的表达无明显差异（P>0.05）（表1）。
2.2 GSTP1蛋白表达与肺腺癌患者临床病理学参数的关系
χ2检验结果显示：GSTP1蛋白表达与肺癌患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及淋巴结转移均无明显相关性（P>0.05）（表1）。
2.3 GSTP1蛋白表达与肺腺癌患者术后生存时间的关系
GSTP1高表达肺腺癌患者术后中位生存时间（37个月）明显低于GSTP1低表达患者（47个月），差异有统计学意义（χ2=4.171，P=0.041）（图2）。
2.4 Western blot结果
Western blot结果显示：肺癌旁组织 GSTP1/GAPDH灰度比为0.249±0.057，腺癌组织为0.370±0.089，鳞癌组织为0.337±0.084。与癌旁组织相比，GSTP1在肺腺癌与鳞癌中表达明显上调（t=2.545，P=0.023；t=2.337，P=0.035）（图3）。
3 讨论
研究发现，卵巢正常组织、良性病变及癌变组织中，GSTP1表达阳性率逐渐上升；肿瘤分化程度越低、临床分期越晚其表达越强［11］；乳腺良性病变、乳腺癌组织中GSTP1表达水平明显高于乳腺正常组织［5］；唾液腺腺样囊性癌中GSTP1的表达也明显高于癌旁腺体［13］。但在结肠癌及前列腺癌中，GSTP1低表达或缺失能够促进肿瘤的发生［8，10］。此外，GSTP1可增强癌细胞对抗肿瘤药物的代谢与转运能力，使细胞产生抗药性。提示GSTP1与肿瘤中发生、发展及化疗耐药密切相关［14］。本研究通过免疫组化和Western blot证实，GSTP1在肺腺癌及鳞癌中的表达明显高于癌旁正常组织。虽然目前未见有关GSTP1在原发性肺腺癌、鳞癌及正常组织中表达差异的报道，但在非小细胞肺癌中已证实，GSTP1在肿瘤中表达水平明显高于癌旁正常组织［3，4］。提示GSTP1在癌变组织内的高表达可能是一种诱导表达的结果，即其在肿瘤恶性转变过程中被诱导激活而获得较高的表达
量，GSTP1基因的转录激活是化学致癌早期或启动阶段的重要分子事件，很可能是一个启动信号或标志［15］。但GSTP1在不同病理类型及不同组织来源的肺癌中表达无明显差异，这与韩志刚等［16］报道另一个GST家族成员GST-π在非小细胞肺癌、肺鳞癌及腺癌中表达的结果一致。提示GSTP1不能作为判断肺癌病理类型及癌组织来源的一个可靠指标。