热休克蛋白70及其对精子影响作用的研究进展
哈斯高娃，陈小辛，娜仁花
（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室,
呼和浩特010018）
中图分类号：S823.3文献标识码：A文章编号：1004-4264（2021）03-0020-04
DOI:10.19305/jki.11-3009/S.2021.03.005
微侑扫描二维码
听独家语音介绍
写作者在线交流
开学债s®务)
SiRW(OSID)
摘要：分子伴侣是正常细胞和细胞损伤不同阶段蛋白质动态平衡的关键决定因素，热休克蛋白70（HSP70）是普遍存在的分子伴侣，具有多种细胞功能。伴侣蛋白通过利用各种独特的机制来维持细胞中正确的蛋白质折叠，以防止分子间的异常相互作用，防止蛋白质聚集以及蛋白质重折叠等，且HSP70在细胞中与辅助伴侣蛋白协同互作，这些辅助伴侣蛋白由J-结构域蛋白和核昔酸交换因子组成，调节HSP70与伴侣蛋白循环。本文对HSP70的结构、功能以及对精子功能的关系进行综述，对HSP70分子伴侣如何调控细胞功能以及精子功能的分子机制提供了新的见解。
关键词：分子伴侣；HSP70；蛋白质折叠；翻译后修饰
为了生存，生物体必须能够在不断变化的环境中保持细胞的动态平衡，分子伴侣对这一过程有着至关重要的作用，它们有助于保护细胞蛋白质免受极端条件，如温度突然升高、氧化应激、接触重金属、缺氧和代谢功能障碍等的破坏⑴。热休克蛋白（HSPs）位于细胞质（包括各种细胞器，如线粒体）、细胞核、细胞质膜等3个细胞区室，并在细胞外完成任务伺。HSP参与一系列细胞过程，包括蛋白质折叠和重折叠、运输、移位、解聚和降解冏，而且还与人类的许多病理生理疾病相关，包括神经退行性疾病、癌症⑷和生物衰老同等。
收稿日期：2020-08-27
基金项目：内蒙古农血大学动物科学学院标志性成果专项资金项目青年基金项目（DC1900006998）；
内蒙古自治区自然科学基金
项目（2017MS0344）。
作者简介：哈斯高娃，博士研究生。
通讯作者：娜仁花，教授，博士生导师，主要从事生殖生物学与生物技术研究。1HSP70的结构
哺乳动物热休克蛋白根据分子大小分为五个家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSPs，热休克蛋白家族中的每个成员可以独立地作用于底物或形成由多个伴侣组件组成的大的多分子复合物冏。HSP70家族是HSPs中最保守、研究最深入的一类。HSP70有两个结构域：N端核昔酸结合域（NBD）约40kDa,C端底物结合域（SBD）约30kDaE。HSP70的功能要依赖于ATP（三磷酸腺昔）,ATP与HSP70的核昔酸结合域（NBD）结合，通过结构域连接到底物结合结构域（SBD）[8l o HSP70的核昔酸结合状态决定了伴侣与底物的结合亲和力，在ATP水解过程中，分子伴侣在NBD和SBD之间表现出特殊的变构行为。当ATP与NBD 结合时，HSP70与底物结合松散，并以“开放”构象存在。但当伴侣切换到ADP（三磷酸腺昔水解产物）结合
20
形式时，a螺旋呈“封闭”构象回，在天然构象的疏水核心中发现有残基，据估计，大多数蛋白质每30~40个残基就有一个HSP70结合位点何。HSP70基因在进化上具有高度保守性，但在同一体中存在多态性X。
2HSP70生物学作用
HSP70通过动力学分配过程参与蛋白质折叠敗）、蛋白质移位、蛋白质复合物的分解、抑制蛋白质聚集以及聚集蛋白的溶解和重折叠阳。为了执行这些不同的功能，HSP70可以在不同的模式下运行，并与各种其他细胞器协同工作。在细胞环境中，核糖体结合的伴侣触发因子与核糖体上新生的链相互作用，触发因子（TF）可以与新生蛋白链结合并在有限的时间内移动，从而促进胞浆蛋白的折叠。除了与触发因
子的相互作用外，一些蛋白质还需要HSP70分子伴侣系统和HSP60分子伴侣系统进行进一步折叠辅助，对于一些蛋白质，有效的折叠需要连续的结合步骤和在两个伴侣系统之间穿梭网。HSP70在蛋白质折叠中受活性HSP40（或J结构域）蛋白和核昔酸交换因子（NEF）的调节，各种核昔酸交换因子（NEFs）通过解离结合的ADP和HSP70并导致ATP重新结合阳。
在后生动物中，HSP70家族成员与JDPs和NEFs形成一种蛋白质解聚机制，可以溶解广泛的无定形和淀粉样聚集体，这种机制可抑制慢性蛋白质错误折叠何、应激引起的蛋白质聚集和由于细胞老化和疾病期间蛋白质质量控制通路的衰退或崩溃而导致的蛋白质聚集[17'18l o HSP70参与细胞正常的生长、发育和分化过程，其除了具有帮助蛋白质折叠等分子伴侣生物功能之外，还有保护细胞、抗细胞凋亡、抗氧化、免疫调节等生物学作用阳。
3HSP70对精子的影响
热应激影响动物生理和生产性能，选择耐热奶牛并阐明其潜在的耐热性机制对奶业至关重要。有研究通过高通量测序和生物信息学分析对中国荷斯坦牛耐热性相关基因及其分子机制进行分析，发现与非耐热（NHT）奶牛相比，耐热（HT）奶牛的直肠温度（RT）、呼吸频率（RR）显著较低（P<0.05），而血浆热休克蛋白（HSP：HSP70、HSP90）和皮质醇水平显著升高
（P<0.05）[20l o热休克蛋白不仅与热应激相关，还与氧化应激、重金属接触、缺氧和代谢功能障碍相
关，冷冻精液的精子质量、精子功能亦与精子中的HSP70相关，HSP70基因也可能是生物耐寒抗冻的潜在基因。3.1HSP70与精子质量
多态性的作用有研究发现精子活力会因为精子膜蛋白异常折叠导致膜的流动性降低而受到影响，冻融精子的活力与HSP70的含量呈正相关，将HSP70蛋白添加到冷冻精液中能显著提高精子的活力旳。有研究检测HSP70表达时发现男性无精子症组未见HSP70表达，而不育组HSP70表达水平明显高于正常生育组（P<0.05），不育男性精子中除了DNA损伤增加外，HSP70的表达也有所增加，这可能是诱导型HSP70蛋白有助于阻断受损蛋白的聚集和折叠，作为一种普遍的保护反应导致的现象田。
有研究表明，HSP70家族成员可有效改善公牛精子的冷冻效果，但其效果取决于其使用方式。如低浓度的HSP70家族成员HSPA8可使质膜相互作用伴有高亲和力、产生有害相互作用，而相反，涉及较高蛋白质浓度的相互作用是具有保护作用的凹。人精子DNA完整性和染质成熟程度与精子中HSP70家族成员HSPA2水平相关，HSPA2有可能作为评估ART精子（用于人工授精的精子）质量的生物标志物创。HSP70家族成员HSPA4L 与精子质量异常有关“列，有研究报道，与成熟精子相比，未成熟精子和弱精子中HSP70家族成员HSPA4L的表达强度和定位百分率均较低，可见HSPA4L是一种潜在的精子质量评估指标瓯。
Sylvia等在一组获能能力较差的精子中发现了DNA 损伤，并在热处理后观察到凋亡，结果提示，精子功
能障碍可能是由于环境温度升高导致精子DNA凋亡所致。在另一组高获能精子中，则表现出诱导的热休克蛋白HSP70等伴侣蛋白的表达，该表达保护了精子免受凋亡“刀。有研究结果表明，人射精精子中存在特异性miRNAs的表达，这些miRNAs似乎参与调节HSP40、HSP70和HSP90的表达，进而影响精子功能购。
在牛精液的冷冻过程中HSP70基因表达量逐渐降低，且各时期的表达量有显著差异。新鲜精子的HSP70基因表达量显著高于平衡后的精子（P<0.05），平衡后的精子表达量又显著高于解冻后的精子（P<0.05）o随冷冻过程的进行，牛精子的质量有所降低。精子HSP70
21I
基因表达量与精子活力呈正相关画。
3.2HSP70与精子和透明带的结合能力
HSP70家族成员HSPA2的表达水平与精子细胞成熟度、受精能力密切相关网）。HSP70定位于成熟公牛的精子中，在获能和顶体反应过程中发生蛋白的重新分布。有文献报道HSP70在牛精子以及在精子发生的不同阶段的亚细胞定位，HSP70定位于粗线期精母细胞和长形细胞的细胞质，以及附睾头部精子的原生质滴，以及在附睾体和尾部精子的原生质滴、顶体、顶体后区和中段。在新鲜射精中只在精子顶体中被观察到，在获能和顶底反应过程中HSP70被重新分布，位于精子的赤道段、顶体后区和中段列。
有研究探讨冷冻保存对水牛精子中HSP70分子水平和分布模式的影响，免疫细胞化学结果显示，HSP70主要分布在未冷冻水牛精子的顶端和顶体、顶体后端和精子中段，冷冻一次后，精子头部顶区荧光信号明显丢失（P<0.05）。研究证实了水牛精子冷冻解冻后头部HSP70的丢失，这可能是该物种精子解冻后受精率降低的原因之一昭。HSP70表达水平与公猪精液质量性状呈正相关，精液中HSP70水平的降低在一定程度上可能是导致受精能力降低的原因之一卩叭宫颈阴道液（CVF）在性交、精子运输和获能以及受精卵着床过程中起着重要作用，它被认为是一种很好的非侵入性生物标志物，可用于各种诊断目的。对水牛CVF在发情周期中的蛋白质表达进行分析，发现发情期CVF中HSP70的表达水平高于非发情期网，与发情间期相比，发情期是生殖周期中确保授精成功的最关键的时期，HSP70可能作为精子获能和发情的标志蛋白。
4总结与展望
繁殖障碍会增加牲畜养殖成本，减少生产数量，最终会影响经济效益。而精卵识别与结合失败是雄性不育的主要生殖损害之一，精卵融合是复杂的过程，在此过程中很可能由多个蛋白质通过形成功能复合物来调节这一过程，然而一些实验数据表明，在这一过程中缺陷的精子中，关键分子伴侣HSP70的表达量不足。分子伴侣HSP70在精子发生阶段以及精子与卵母细胞相互作用方面起着至关重要的作用，此文章综述了HSP70结构，HSP70对精子功能的影响，然而有关HSP70结合到配子中的途径以及它是如何调节参与精卵融合机制，并如何作用于畜禽繁殖有待更深一步地研究。
参考文献
[1]Mendillo,M.L.,  D.Pincus,R.Scherz—Shouval.HSF1and
Molecular Chaperones in Biology and Cancer[J].Advances in Experimental Medicine and Biology,2020.
[2]M,S.,B.乙K.W,et al.Membrane—Associated Heat Shock
Proteins in Oncology:From Basic Research to New Theranostic Targets[J].Cells,2020,9⑸:1263.
[3]D,B.,H.—H.M,H.FU.Recent advances in understanding
catalysis of protein folding by molecular chaperones[J].FEBS Letters,2020,594(17).
[4]Murphy,M.E.The HSP70family and cancerQ].Carcinogenesis,
2013,34(6):1181-1188.
[5]DM,W.,K.P,Z.M,et al.Widespread Proteome Remodeling
and Aggregation in Aging C.elegansfj].Cell,2015,161(4):919—932.
[6]Srivastava,S.,V.Vishwanathan,  A.Birje,et al.Evolving
paradigms on the interplay of mitochondrial Hsp70chaperone system in cell survival and senescence[J].CRC Critical Reviews in Biochemistry,2019,54(6):517—536.
[7]D,B,H.—H.M,H.FU.In vivo aspects of protein folding
and quality control[J].Science(New York,N.Y.),2016, 353(6294):aac4354.
[8]Bertelsen,  E.B.,L.Chang,J.E.Gestwicki,et al.Solution
conformation of wild—li Hsp70(DnaK)chaperone complexed with ADP and substrate[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(21):8471—8476.
[9]Mayer,M.P.,H.Schroder,S.R ii diger,et al.Multistep
mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70|J].Nature Structural Biology,2000,7(7):586—593.
[10]Craig,A.Elizabeth.Hsp70at the membrane:driving protein
translocation[J].Bmc Biology,2018,16(1):11.
[11]李显，龙开旭，俸祥仁，等.河流型水牛热休克蛋白7CKHSP70)基
因CDS序列的多态性分析[J]•上海畜牧兽医通讯，2019,05:2-8.
[12]FU,H.,H.—H.M.Converging concepts of protein folding in
vitro and in vivo[J].Nature Structural&Molecular Biology,2009, 16(6):574-581.
[13]R,R.,N.NB,M.MP,et al.,The Hsp70chaperone networkQ].
Nature Reviews.Molecular Cell Biology,2019,20(11):665—680-[14]Kramer,G.,D.Boehringer,N.Ban,et al.The ribosome as a
platform for co—translational processing,folding and targeting of newly synthesized proteins[J].Nature Structural&Molecular Biology,2009,16(6):589-597.
[15]S,T.,W.j MJ,S.K,et al.Functional divergence between co­
chaperones of Hsc70[J].The Journal of Biological Chemistry, 2008,283(40):27100-27109.
[16]MS,H.,P.SH and H.FU,Proteostasis impairment in protein­
misfolding and—aggregation diseasesQJ.Trends in Cell Biology, 2014,24(9):506-514.
[17]EM,S.,S.RS,F-J.Mechanisms and Functions of Spatial Protein
Quality Control[J].Annual Review of Biochemistry,2017, 86:97-122.
[18]A,M.,  B.  B.Role o£sHsps in organizing cytosolic protein
aggregation and disaggregation[J].Cell Stress&Chaperones,2017,
22
22⑷:493-502.
[19]樊欣，彭仁.热休克蛋白70：生物学功能与作用机制研究进展卩
生命科学,2019,31(03):270-278.
[20]Liu,S.,T.Yue,M.Ahmad,et al.Transcriptome Analysis Reveals
Potential Regulatory Genes Related to Heat Tolerance in Holstein Dairy Cattle[J].Genes,2020,11(1):68.
[21]彭乔烽，陈朗，马小梅，等.热休克蛋白HSP70家族功能研究进
展[J].甘肃畜牧兽医，2019,49(05):18-20.
[22]Erata,G.,N.Ko^ak Toker,O.Durlanik,et al.The role of heat
shock protein70(Hsp70)in male infertility:is it a line of defense against sperm DNA fragmentation?Q].Fertility and Sterility,2008, 90(2):322—327.
[23]Holt,W.,I.Del Valle,A.Fazeli.Heat shock protein A8stabilizes
the bull sperm plasma membrane during cryop r eservation: Effects of breed,protein,concentration,and mode of use[J].
Theriogenology,2015,84⑸:693—701.
[24]Heidari,M.,S.Darbani,M.Darbandi,et al.Assessing the
potential of HSPA2and ADAM2as two biomarkers for human sperm selection!}].Human Fertility(Cambridge,England),2020, 23(2):123—133.
[25]Liu,X.,X.Shen,  F.Liu.Screening targeted testis—specific genes
for molecular assessment of aberrant sperm quality[J].Molecular Medicine Reports,2016,14⑵:1594—1600.
[26]Liu,X.,X.Wang,  F.Liu.Decreased expression of heat shock
protein A4L in spermatozoa is positively related to poor human sperm quality[J].Molecular Reproduction,and Development, 2019,86(4):379-386.[27]Mann,S.,W.Patton,  A.King,et al.,Comparative genomic
hybridization analysis of sperm DNA apoptosis after exposure to heat shockfj].Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2002,19⑷:195-200.
[28]Tang,W.,D.Liu,H.Kai,et al.miRNA—mediated regulation of
heat shock proteins in human ejaculated spermatozoafj].Turkish Journal of Medical Sciences,2015,45⑹:1285—1291.
[29]王艳凤.冷冻前后牛精子活力与HSP70基因表达相关性研究
[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.
[30]Huszar,G.,A.Jakab,D.Sakkas,et al.Fertility testing and ICSI
sperm selection by hyaluronic acid binding:clinical and genetic aspectsQ].Reproductive Biomedicine Online,2007,14(5):650—663.
[31]Kamaruddin M,Kroetsch T,Basrur P K,et al.Immunolocalization
of heat shock protein70in bovine spermatozoaQ].Andrologia, 2004,36⑸:327-334.
[32]Varghese,T.,  B.C.Divyashree,S.C.Roy,et al.Loss of heat
shock protein70from apical region of buffalo(Bubalus bubalis) sperm head after freezing and thawingQ].Theriogenology,2016, 85(5),828—834.
[33]Spinaci,M.,C.Vallorani,D.Bucci,et al.Effect of liquid storage
on sorted boar spermatozoaQ].Theriogenology,2010,74(5):741—748.
[34]Muthukumar,S.,R.R.ajkumar,K.Karthikeyan,et al.Buflalo
cervico—vaginal fluid proteomics with special reference to estrous cycle:heat shock protein(HSP)—70appears to be an estrus indicatorQ].Biology of Reproduction,2014,90⑸:97.
Research Progress of Heat Shock Protein70and Its Effect on Sperm
Function
Hsaigaowa,CHEN Xiao-xin,NA Ren-hua
(Key Laboratory of A nimal Genetics,Breeding and Reproduction of Inner Mongolia Autonomous Region,College of A nimal Science,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot010018)
Abstract:Molecular chaperone is a key determinant of protein dynamic balance at different stages of normal and cell injury.Heat shock protein70is a ubiquitous molecular chaperone with a variety of cellular functions. Chaperones use a variety of unique mechanisms to maintain correct protein folding in cells to prevent abnormal interactions between molecules,to prevent protein aggregation and protein refolding,and HSP70proteins interact with co-chaperones in cells,these co-chaperones are composed of J-domain proteins and nucleotide exchange factors to regulate HSP70chaperone protein cycle.This
paper reviews the structure,functionof HSP70protein and the relationship between HSP70molecular chaperone and sperm function,and provides new insights into how HSP70 molecular chaperone regulates cell function and the molecular mechanism of sperm function.
Key words:Molecular chaperone;HSP70;Protein folding;Post-translational modification'^
23