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收稿日期:2001-10-21；修回日期:2002-01-15
作者简介：王志林(1976-)，男，硕士生。赵树进(1958-)，男，双博士，教授，主任药师，博士导，研究方向，神经生化，现代药理、中药。
分子标记技术及其进展王志林1，吴新荣2，赵树进
2
(11华南理工大学食品与生物工程学院，广东广州510640;
21广州军区总医院，广东广州510010)
摘要：综述了几类分子标记的概念、基本原理，并简要地介绍了各种技术的优缺点。
关键词：分子标记;DNA 多态性；指纹图谱
中图分类号:Q75  文献标识码:A  　文章编号:1004-311X (2002)03-00封2-01
  DNA 分子标记本质上是指能反映生物个体或种间基因组中某种差异的特异特DNA 片段[1]。DNA 分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA 差异，通常也称为DNA 的指纹图谱。
DNA 分子标记技术的研究始于1980年，现在DNA 标记技术已有数十种，广泛应用于作物遗传育种、基因组作图、基因定位、植物亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。本文仅就几类主要分子标记技术作一简单介绍。
1　基于分子杂交技术的分子标记技术
111　限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length P oly 2m orphism ,RF LP )
1980年Botstein 等[2]首先提出利用RF LP 作为标记构建遗传图图谱。RF LP 基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA ，得到大小不等的DNA 片段，所产生的DNA 数目和各个片段的长度反映了DNA 分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，
dna多态性然后与克隆DNA 探针进行S outhern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RF LP 图谱。它所代表的是基因组DNA 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
RF LP 的等位基因具有共显性特点。RF LP 标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1～4个[3]。RF LP 技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA 多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高[4]。
112　数目变串联重复多态性(Variable Number of T andem Re 2peats ,VNRT )
真核生物基因组中存在着许多非编码的重复序列，按其在DNA 分子上分布的方式，可分为散布重复序列和串联重复序列，而串联重复序列又根据重复单位大小不同可分为:(1)小卫星序列，重复单元核心序列含有6～70bp ，中间无间隔，总长度一般小于1kbp ;(2)微卫星序列，或称简单重复序列(S im 2ple Sepuence Repeats ,SSR )，重复单元含有1～6bp [5,6]。
小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同从而构成丰富的长度态性。在基因组多态性分析上，可采用VNTR 标记技术区别这些小卫星或微卫星序列的差异。VNTR 基本原理与RF LP 大致相同，只是对限制性内切酶和DNA 探针有特殊要求，限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。另外，内切酶在基因组的其
他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。分子杂交所用DNA 控针核苷酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA 指纹图谱[7]。
VNTR 一次可检测到基因座位数可达几十个，同RF LP 标记一样,VNTR 实验操作程序繁锁，检测时间长，成本耗费较高[8]。
2　基于PCR 技术分子标记技术
211　随机扩增多态性DNA (Random Amplified P olym orphism DNA
RAPD
)RAPD 技术是由Williams [9]和Welsh [10]同时发展起来的一种新型遗体标记技术的。RAPD 基本原理：它是利用随机引物(一般为8～10bp )通过PCR 反应非定点扩增DNA 片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA 片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA 多态性。RAPD 所使用的引物理各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN 片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA 多态性，但利
用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此,RAPD 可用于对整个基因组DNA 进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
与RF LP 相比,RAPD 具有以下优点:(1)技术简单，检测速度快;(2)RAPD 分析只需少量DNA 样品:(3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析;(4)成本较低。但RAPD 也存在一些缺点:(1)RAPD 标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子;(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA 片段，而不能分开那些长度相同但碱基序列组成不同的DNA 片段;(3)RAPD 技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差[6]。
与RAPD 技术类似的还有AP —PCR (Arbitrary Primed PCR )标记和DAF (DNA Amplified Fingerprints )标记。21111　任意引物PCR (AP —PCR )
在AP —PCR 分析中，所使用的引物较长(10～50bp ),PCR 反应分为两个阶段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板DNA 退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增[11]。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR 产物，最终反应结果与RAPD 类似。
只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP —PCR 谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样,
50个引物能产生(50)2/2=1250种不同指纹图谱[10]。
AP —PCR 方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的,AP —PCR 还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性[11]。AP —PCR 的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。21112　DNA 扩增指纹(DAF )
DAF 是一种改进的RAPD 分析技术，与RAPD 技术不同的是,DAF 分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为5～8bp )，因此它所提供的谱带信息比RAPD 大得多，如当使用5个核苷酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10～100个DNA 片段。PCR 扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型[12]。212　序列标志位点(STS )
STS 是对以特定对引物序进行PCR 特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA 序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。利用特异PCR 技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RF LP 和RAPD 那样存在某种模糊性。
(未完待续，见下期)
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