Sanger测序“精准医疗”首选
Sanger测序是基因检测的金标准，当前我国“个性化医疗”应优先推广
作者：李甫  测序从业15年，资深基因检测专家          单位：北京三博远志生物技术有限责任公司
摘要：上个世纪末90年代，与“曼哈顿计划”和“登月计划”具有同样划时代意义的“人类基因组计划”启动，这是人类第一次在分子水平上全面地认识自我。随着人类基因组计划的开展，人们对基因与疾病的关系认识更加深入，有机会通过对基因缺陷的检测分析来判断各种疾病发生的风险，并由此衍生出一种新的健康服务项目—基因检测。
“个性化医疗” 即“精准医疗”就是指根据病人(或亚健康人)的个人基因组信息，量体裁衣式地制定个性化方案（健康管理方案）。它是由传统医疗联合遗传检测技术，为病人(或亚健康人)量身设计出最佳方案（健康管理方案），以期达到效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。
Sanger测序经过38年的发展已相当完善，成本也降低了10倍以上，现在国际上仍然是基因检
测行业的金标准和主力军。sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准，是包括荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。
2010年以来，出现了很多新一代测序仪产品，新一代测序成本低、数据大、速度快，但都有待成熟，准确度不够高。临床应用人命关天，精确第一。我们对基因的了解还非常肤浅，有待去挖掘解读，一代测序要发挥精准、成本低的优势用于临床检测和验证，新一代测序要发挥高通量的优势用于研发和大数据的遗传检测。
一代测序技术
（一）、Sanger测序
被检测的DNA碱基顺序依次读出800bp以上，是一代所有测序和新一代所有测序的金标准。代表仪器美国ABI 3730XL，Sanger测序一般医院很少开展，开展的都发公司做。耗时长达 13年之久的人类基因组计划也是依靠Sanger测序法才得以最终完成的。Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 扩增直接测序。单个突变点的扩增（包括该位点在内的外显子部分片段的扩增），不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。所以单基因或部分基因控制的疾病样本检测，Sanger 测序可以发挥精准和成本低的优势。
●sanger测序的应用领域：
1、应用于医学测序、健康管理和基因潜力开发的精准检测：
将待检测DNA样本的某一个片段的碱基逐一精确检测，然后与已知的标准样本序列比较，寻突变，发现突变与疾病（或能力、特点）的关系。包括单基因遗传病检测、易感基因精确筛查、健康能力基因检测、个性化用药精确检测、血液和器官配型基因检测、天赋基因检测、个性特质、性格特点基因检测等。
目前该技术已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和等临床实践中。如p53基因、BRCA基因、APC基因的检测分析，可用于早期发现某些肿瘤的易感人，如：乳腺癌、结肠癌，对这些人采取必要的生活方式调整、早期诊断及其它干预措施，从而达到预防医学治未病的效果。Sanger 测序可以助力癌症病人个性化用药，应用Sanger测序法对肿瘤靶向药物相关基因的突变位点进行检测，结果直观、可靠，例如：K-ras基因、C-kit基因、EGFR基因序列的突变检测分析，应该是判断肿瘤患者靶向的有效人，必不可少的检测项目，例如：非小细胞肺癌，靶向药吉非替尼（易瑞沙）/厄洛替尼（特罗凯）/埃克替尼（凯美纳），用药前需检测EGFR突变，西妥昔单（爱必妥）/帕尼单抗（维克替比），用药前需检
测K-ras突变， EGFR突变情况。
Sanger 测序检测不同个体细胞素P450耐药性基因，可以确定不同人对药物的敏感性和耐受程度，是个人用药剂量确定的重要依据。
国外，Sanger测序技术在临床方面的应用主要有两个途径，即商业化检测试剂盒的应用和CAP认证独立实验室进行相关项目的检测，例如：HIV耐药突变检测试剂盒的商业化。在美国，医学独立实验室必须具有CAP(College of Ameican Pathologists，美国临床实验室／病理学家学会)认证资质，其在法律上是独立的经济实体，有资格进行独立经济核算并承担相应法律责任，在管理体制上独立于医疗机构，能立场公正地提供第三方医学检验，实验室本身对出具的检验报告负责。
发达国家Sanger测序技术已广泛应用于临床相关诊断和中。Sanger测序在我国临床应用较少。
2、为二代和芯片测序验证：
    二代和芯片测序结果，需要sanger测序验证，原因请见“Sanger测序与其他测序方法流程
、准确度对比”论述。
3、应用于细菌、真菌鉴定：
精确确定细菌、真菌、病毒种属，为微生物开发利用或杀灭提供依据，广泛用于食用菌和益生菌开发利用（例如：食用菌品种开发改良、发酵工业、植物品种改良、石油地矿勘探等），解决饮料、食品、医药、酒类、包装等行业菌污染问题。用sanger测序，在临床上通过16SrDNA等基因定序，实现各种感染性疾病的病原学精确诊断。用sanger测序技术检测比传统的形态学鉴定具有方法简单结果准确的优势。
4、应用于科研基础测序：
sanger测序38年来立下了汗马功劳，sanger测序用13年完成人类基因组计划，现在NCBI公布的动、植物、微生物基因组序列都是由sanger测序完成的。现在sanger测序仍然在临床科研、药物研发、动植物育种等方面发挥着不可替代的作用。
●Sanger测序的优势：
1、精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。
1.1、由于没有建库环节，所以微量样品不会任意扩大，从而产生假阳性结果（与二代测序比）；
1.2、sanger测序首先要做PCR有限扩增，然后切胶回收主带，此过程不容易污染，即使有少量污染扩增出的杂带，切胶回收可以有效分离，切胶回收后，电泳前要用特异性单引物测序PCR反应一次，等于又筛选了一次，所以sanger测序这种方法非常精准，非常不容易污染。
1.3、sanger测序是建立在目的基因精确物理定位基础上的测序（得到的结果是连续的、可视的、真实的长片段，所以出来的数据不会张冠李戴，即使读错了结果，也可以从读取的峰图序列中判出（与荧光定量 PCR Taqman 探针法、普通PCR法、质谱法、芯片法、二代测序法等方法比）；
1.4、基因突变可分为碱基置换、颠换、缺失和插入4种，sanger测序法对于任何一种突变都可以清楚读出，而无需提前预测、预置模版造成误断结果。（与荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、质谱法等方法比）；
1.5、分子生物学实验是微观实验影响因素众多，由于样品和操作的差异，实验经常会出现失败，而做不出数据现象（这个概率至少是10—20%左右，其他测序方法判断是阴性结果，这样结果用于临床是否有点可怕？），而用sanger测序法检测，如果琼脂糖凝胶电泳之前和电泳过程中，任何工序不理想，都无法进行下一道工序，也就无法拿到序列峰图，这种情况必须重新实验，这种情况sanger测序绝不会当阴性结果出具报告。（与荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法比）。
sanger测序是目前所有基因检测dna多态性的国际金标准，是包括荧光定量PCR Taqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，必须要有sanger测序验证数据予以支持。
2、可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序，sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是：“目标明确、结果精准、通量小”，Sanger 测序正好具备这个特点，非常适用于临床。
●我国sanger测序历史与现状：
最好的Sanger测序仪器是美国ABI 3730XL系列产品，其他厂家仪器都被淘汰。我国从2000年左右开始做sanger测序，当时主要用的是手工灌胶、手工点样、大板胶电泳的ABI 377测序仪，和读长较短的MegaBACE DNA毛细管测序仪。2002年，三博远志公司率先开始使用读长更长、全自动、毛细管核酸分析仪3730XL，引入全新3730 XL操作技术，承包中国农科院闲置未用的两台仪器，把有限的测序资源变成了社会化服务，面向全国各高校、生命科研院所、医院等单位，为我国分子生物学研究发挥了重要的作用。2008年4月，ABI生产的3130／3130XL测序仪获得中国CFDA颁布的医疗器械生产许可证备案[1]。
现在做sanger测序的公司集中在北京和上海，其他地方如有大部分是分公司，只收样不测序。sanger测序经过15年市场自由竞争，现全国比较有规模的有20多家。测序速度由原来的3天出结果，到现在12到20小时出结果，测序公司三班倒不间断提供服务，价格也成几倍下降。由于国内众公司参与竞争，市场价格的降低、测序质量和服务质量的提升，原来的外资公司和国企测序公司难以为继，这几年纷纷撤出、转型，例如：当年测序业务火爆的大连的日资宝生物公司几年前就撤出了测序市场、美资的英潍捷基公司被赛默飞世尔收购，现在测序业务基本放弃，2010年华大公司主要力量转到了深圳做了二代产前唐筛，私企三博远志公司也开始转型到基因检测应用领域，重点为医院和健康管理提供咨询服务。
sanger测序成本的大量降低和服务水平的不断提高，原来拥有测序仪器的科研单位和医院，在项目申请时必购置的仪器，由于缺乏专业的维护管理（毛细管核酸分析仪必须天天使用，否则仪器毛细管堵塞测序结果会很差，分析仪器要求每天必须有大量样品去跑板，否则就得空跑，导致维护仪器成本极高）样品数量问题、人员技术问题、成本问题，使国家大部分仪器都成了摆设，现在这项服务90%以上靠生物公司社会化提供。
现在由于国家发改委物价局没有给sanger测序服务核定收费名录，所以该项目一般医院很少开展，少数开展的三甲医院由于sanger测序上述特点不适宜在医院做，适合在第三方专业检测机构做，一般都发到公司测的。
国内用药都是按照说明书程式化使用，基因检测个性化用药几乎是零。得了癌症手术、化疗、生物靶向药物、放疗、中药一起用，多种药重复用，哪个药贵用哪个，导致疗效差、副作用大、医药资源浪费。2014年统计，发达国家癌症治愈率达到65%。而没有大规模开展基因检测的中国，癌症治愈率仅为25%左右！另人痛心[2]。
以上局面的产生主观上是医院创收的驱动，及病人、家属治愈心切的驱使，但客观上是国民包括医生缺乏基因检测及个性化用药知识的普及和基因检测应用的环境（审批环境），部分
癌症病人为了解决个性化用药问题直接公司。公司因法律限制是不能直接接收的（sanger测序拿不到临床证）。