新型冠状病毒核酸检测中的质量控制问题与对策
摘要】新型冠状病毒肺炎（CoVID-19）在全国发生流行传播，甘肃省武威肿瘤医院被甘肃省卫健委确定为新型冠状病毒核酸检测定点医院。本院检验科接到通知，立即开展了人员、设备、试剂、消毒、防护等方面各环节工作的培训，建立了制度规定，制定流程，质量控制等一系列的准备工作。加强新型冠状病毒核酸检测的质量控制，从标本采集运输、保存、核酸检测、结果分析，及时反馈结果给武威市疾控防控相关部门。截止3月31日，本院检验PCR室已完成3835例标本的核酸检测，未发生医源性感染，为武威市的新冠防控工作做出了重要贡献。
关键词：武威市 新型冠状病毒 核酸检测 质量控制
冠状病毒（coronaviruses）在电子显微镜下呈日冕或冠状[1]。全球第一例已知的冠状病毒1937年自病鸡的体内分离出的禽传染性支气管炎病毒；第一例人管状病毒1956年在人类鼻腔分离，但遗传进化分析结果显示，该病毒起源于蝙蝠，并且与人类共存至少500—800年[2.3].2019-nCOV有包膜，呈直径为60—140nm的圆球形或椭圆球形。CoVID-19具有传染性强，危重症死亡率的主要原因是其CoVID-19本身的生物学特性决定的。新型管状病毒和SARS病毒都是属于管状病毒β属，基因组为线性的单股正链RNA,人具有普遍易感型[4]。新型管状
病毒和SARS病毒都是通过利用S蛋白结合人体表面的ACE2蛋白进入细胞的，但二者的S蛋白同源性具有76.4％.2019-nCOV-5SARS-CoV有约70％的基因序列相似性[5].但新型管状病毒的S蛋白三聚体结构更容易与细胞表面的ACE2蛋白易结合，导致新型管状S蛋白与ACE2的亲和力是SARS病毒蛋白与ACE2之间亲和力10—20倍。这就是2019-nCOV的传染性比SARS更强。新型管状病毒肺炎（CoVID-19）在全球范围内具有很高的传播风险，对人类健康安全造成巨大威胁。
新型管状病毒疫情爆发后，2020年1月22日国家卫生健康委发布的《新型管状病毒感染的肺炎诊疗方案试行第二版》中将新型管状病毒核酸检测列为确诊标准。
在疫情发生后，由于需要检测标本多，武威肿瘤医院被甘肃省卫生健康委确定为核酸检测定点医院。接到上级通知，科室成立了以科主任为组长的新型管状病毒核酸检测小组，周密部署，在人员分工﹑设备安置﹑定购试剂﹑试剂性能评价﹑生物安全等方面都进行合理安排。制定了从标本接受﹑灭活﹑试剂准备﹑核酸提取﹑PCR扩增﹑结果判读﹑报告审签发放﹑质量控制﹑数据收集整理﹑实验室人员的安全防护﹑后勤保障都安排到人，责任到人。本实验室到目前（2020年3月31日）已检测新型管状病毒核酸标本3697份。在PCR新型管状病毒核
酸检测过程中，我们制定了从标本采集﹑运送﹑检测﹑报告发放﹑生物安全等方面的制度及工作流程，未发生医源性感染，但在新型管状病毒核酸检测中出现些问题，现将存在的问题和解决对策总结分析：
质量控制采取措施
1.采集、运输、保存
1.1对标本采集人员进行专题培训，网络学习，电话指导等方面开展了细致的岗前培训工作，标本采集建议痰→鼻拭子→咽拭子→血清→粪便→尿液顺序采样。
1.2标本运输按照国家卫健委的指南进行运输。
1.3要求采样单位不保存样本，即采即送。
1.4对采集运输中出现的问题，例如：一个发热人员采集样本分右鼻孔拭子，左鼻孔拭子，分别在两支采样管中，一个密封袋中装3份采样标本，对这些问题及时的进行了指导改正，并汇报新冠防控管理单位，要进一步加强人员培训。
2.新型冠状病毒核酸检测
2.1核酸检测人员在检测前认真阅读试剂说明，仪器操作规程，做到完全掌握。
2.2新冠病毒核酸检测结果要有检验师和主管检验师共同分析确定，对结果存疑的标本更换试剂，更换检验人员，采用手工提取和仪器提取，重新复检，结果由主任检验师，主管检验师分析后确定，确定有异常结果，即刻汇报新冠防控管理部门，再次采样复检确诊。复检时换从事病毒核酸检测20余年的主任检验师，带领从事PCR工作十年的主管检验师，对可疑标本，更换试剂，同时进行人工提取和仪器提取，提取时一律将原标本，二次采集标本同时进行，结果分析由科主任，质深PCR工作人员多人会同分析。
2.3积极参加第三方的室间质评活动，在新冠检测期间，参加了国家卫生健康委临床检验中心，甘肃省临床检验中心，甘肃省医学会检验专业委员会组织的新冠病毒核酸检测室间质量评价活动，均取得合格成绩。
1.标本来源：标本来源于我市凉州区疾控﹑天祝县疾控﹑武威肿瘤医院发热门诊，采集的发热﹑留观﹑疫区来武人员。标本类型主要是咽拭子﹑鼻拭子﹑痰液﹑血清﹑尿液﹑粪便。
2.所用仪器﹑试剂
试验所用扩增仪为ABI7300plus，核酸提取仪为HEMA全自动提取仪,试剂有达安﹑华大、硕世、芯超。
3.实验室﹑人员资质
本实验室按资质﹑人员标准经过甘肃省临床检验中心于2009年审验合格，开展PCR工作的人员均经过甘肃省临床检验中心培训取得上岗证。本科PCR实验室从2009年开始参加国家卫健委临床检验中心的核酸室间质评（定性﹑定量）均取得合格证书。
4.检测方法
新型管状病毒（2019-nCOV）核酸检测：荧光RT-PCR法
5.结果分析（参考ABI7300仪器说明书进行设置）
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Star值End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Star值可以在3—15﹑End值可设在5—20，在Log图谱窗
口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果。
以下是本科在新冠病毒核酸检测中出现异常结果图、复检后的结果图。核酸检测结果阳性参考值阴性
讨论：
影响新冠病毒核酸检测假用性成假阳性的主要因素
1.影响新冠病毒核酸核酸检测假阴性因素:检测结果出现 “假阴性”的主要原因有样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本，样本收集得过早或过晚，没有正确地保存，运输和处理样本、不同试剂盒检测能力不一致等因素。（1）样本来源不一致：鼻姻拭子结果随机性较高，不如深部痰液标本结果可靠。(2|采样的有效性:临床是否真正按规范采到了感染的样本细胞。（3）采样的时机:早期感染可能在肺部的边缘， 病毒在样本中含量很少或没有。导致检测显示为阴性。（4）采样后的样本保存和运输：采样后如果室温间隔时间太长(越过4h)，容易导致病毒核酸降解，从而导致检测结果为阴性。（5）不同来源试剂盒检出率不同：本
实验室前期研究已表明国内不同试剂盒阳性检出率差异较大，部分试剂盒会导致假阴性率显著升高。（6） 各实验室检测结果解读不一致：在检测结果解读时，有些试剂说明书上描述需2个靶标同时阳性才可报阳性，只有一个靶标阳性的这部分检测结果被定为阴性性，其中可能混杂了一部分“假阴性”。按照国家卫健委发布的《新型冠状病毒防控方案（第五版）》要求，各实验室检测结果解读要统一，即ORF1ab和N基因两个均阳性时，结果判定为阳性；若仅ORF1ab或N单基因阳性时， 需要新采样复查，复查后单基因仍为阳性时，则判定为阳 性。本实验室认为处于检测结果位于灰区时，仍需重新采样复查，若结果仍为灰区但扩增曲线有明显起峰时则判为阳性，否则为阴性。
2影响新冠病毒核酸检测假阳性因素：（1） 核酸提取不当:随着新冠样本不断增加，实验室核酸提取面临着巨大的考验。核酸提取环节如果处理不当极易出现核酸污染而产生“假阳性"结果。手工提取过程复杂，步骤较多容易产生交叉污染:常规磁棒法全自动核酸提取仪因磁棒磁力下降可导致磁珠残留或系统内核酸气溶胶浓度增高而出现“假阳性"结果。（2） 液体处理过程中的交叉污染:疫情爆发后，新冠核酸检测人员本身面临较大的心理压力，特别当标本量过大及复检次数增多时，检测人员面对复杂的检测试剂较容易出现样本的错加、漏加等情况，这都可能成为假阳性或假阴性产生的主要来源。（3） 检测结果判读不合理:实验人
员的技术能力也是产生假阳性的重要因素，如荧光定量PCR结果判定时，國值取舍不合适，会直接导致假阳性的发生。（4）检测人员未经过严格培训:检测操作时未遵守规程，如检测的样品在生物安全柜外开盖、不同分区物品混用、实验操作时未按分区进行单向流动、遇到污染的情况能及时进行处理等，以上情况均会导致PCR实验室发生核酸污染。
参考文献
[1]张济,耿兴义,曹若明,等,全球新型冠状病毒感染的研究进展[J.山东大学学报(医学版), 2013, 51(4): 108 112 Chan PKS,Chan MCW. Tracing the SARS-coronavirus.
[2]Journal of Thoracic Disease, 2013,5:S118-S121. Berry M,Gamieldien J,Fielding BC.Identification of
[3]New Respiratory Viruses in the New Millennium.Viruses-Basel,2015,7(3):996-1019.
沈军,俞蕙,朱启镕.人冠状病毒与人类呼吸道感染[J].中国
[4]《中国-世界卫生组织新型冠状病毒肺炎（COVID-19）联合考察报告》
[5]Xintian Xu, Ping Chen, Jingfang Wang, et al. Evolutionof the novel coronavirus from the ongoing Wuhar outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Science China Life Sciences，2020
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