人民医院基因扩增实验室丙型肝炎病毒核酸检测标准操作程序
1  项目名称
丙型肝炎病毒核酸检测
2  检验方法名称
TaqMan荧光定性检测
3  方法学原理
对丙肝病毒进行逆转录反应生成cDNA，PCR扩增时加入一对丙型肝炎病毒cDNA特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比
例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4  标本要求
4.1  血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；
4.2  血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀，5~10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管；
4.3  标本保存：分离后的血清或血浆在2~8℃条件下保持不应超过72小时；-20℃可保存1个月；要长期保存的，需分装后储存于-70℃。
5  试剂
5.1  试剂名称：丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
5.2  生产厂家：XXXXXXX
5.3  试剂货号：#DA-B070；
5.4  包装规格：10人份/盒；
5.5  试剂成份:
组成部分
数量
主要组成成份
RNA提取液A（100µl/管）
1管
二氧化硅、DEPC水（pH2.0）
RNA提取液B（4000µl/管）
1管
GuSCN、Tris-HCl（pH6.4）、EDTA（pH8.0）、Triton-100
HCV PCR反应液Ⅰ（180µl/管）
1管
引物、dNTPs、5×逆转录缓冲液
逆转录酶系（20µl/管）
1管
mMLV逆转录酶、RNasin
HCV PCR反应液（400µl/管）
1管
上下游引物、荧光探针、dNTPs、5×PCR反应缓冲液、双蒸水
Taq酶（30µl/管）
1管
Taq酶原液、Tris-HCl（pH8.0）、KCl、EDTA（pH8.0）、DTT、丙三醇
DEPC H2O（200µl/管）
1管
DEPC H2O
阴性质控品（250µl/管）
1管
HCV阴性血清
HCV临界阳性质控品（200µl/管）
1管
HCV强阳性血浆（2×107IU/ml）稀释1600倍制成
HCV强阳性质控品（200µl/管）
1管
HCV强阳性血浆（2×107IU/ml）稀释16倍制成
HCV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10µl/管 红
1管
含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×105IU/ml）
HCV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10µl/管 黄
1管
含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×106IU/ml）
HCV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10µl/管 蓝
1管
含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×107IU/ml）
HCV阳性定量参考品（1.0×108IU/ml）10µl/管 绿
1管
含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×108IU/ml）
5.6  试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
6  仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7  操作步骤
7.1  RNA提取
7.1.1  阴性质控品处理
7.1.1.1  取出阴性质控品，8000rpm离心数秒；
7.1.1.2  取灭菌的0.5ml离心管加入10µlRNA提取液A（充分混匀后吸取），加入100µl阴性质控品，再加入200µlRNA提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.1.3  加200µlRNA提取液B，充分混匀（用移液器吹打），000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.1.4  加预冷的75%乙醇400µl，充分混匀，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.1.5  加预冷的75%乙醇400µl，充分混匀，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.1.6  打开管盖，65℃干燥10分钟，盖上管盖待用于逆转录。
7.1.2  标本处理（血清和血浆标本处理相同）
7.1.2.1  取灭菌的1.5ml离心管加入10µl RNA提取液A（充分混匀后吸取），加100µl血清，再加入200µl RNA提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.2.2  一下步骤同“阴性质控品处理”的7.1.1.3~7.1.1.6.
7.1.3  HCV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.4  HCV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5  HCV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用；
7.2  逆转录
7.2.1  向干燥后的沉淀管加入18µl PCR反应液Ⅰ打匀，再加逆转录酶系2µl，振荡混匀；
7.2.2  37℃放置45分钟，95℃加热3分钟。8000rpm离心1分钟，待用。核酸检测结果阳性参考值阴性
7.3  PCR扩增
7.3.1  试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HCV PCR反应液40µl/人份+ Taq酶3µl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43µl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.3.2  加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入逆转录后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液5µl，或直接加入阳性定量参考品5µl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.3.3  设置PCR循环扩增程序如下