医学医疗：Image?Pro Plus图像分析软件定量鸡胚尿囊膜血管新生面积的方法
www.zige365 2009-5-12 15:35:58 点击： QQ次 发送给好友 和学友门交流一下 收藏到我的会员中心
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【摘要】  目的 应用Image Pro Plus 5.0图像处理和分析软件，研究鸡胚尿囊膜 (chick chorioallantoic membrane，CAM) 血管新生面积定量的新方法。方法 20只发育良好的7日龄鸡胚，分为龙葵给药组和对照组，每组10只。将中药龙葵水提液及等量蒸馏水吸附于5 mm直径的定性滤纸，置于CAM上。利用Image Pro Plus 5.0软件，定量血管新生面积、蛋壳开窗处对应的CAM面积，计算出血管新生面积与CAM面积的比值。结果 用Image Pro Plus 5.0可方便、自动、准确地进行给药前后的数据收集和面积计算。统计分析表明，受试物龙葵可明显抑制CAM血管新生，与对照组比较有极显著差异(P<0.001)。结论 Image Pro Plus 5.0图像处理和分析软件是一种高效、准确的统计血管新生面积的工具，用该软件定量蛋壳开窗部位下的血管新生面积占开窗部位所对应的CAM总面积，不仅操作简便，而且数据计算自动生成，可较准确地反映鸡胚血管新生情况。
【关键词】  图像分析 Pro Plus 5.0 血管新生定量 鸡胚尿囊膜
    Quantitation of Angiogenesis in Chick Chorioallantoic Membrane
    Using Image Pro Plus Software
    XU Yang1，ZHAO Ying kai2，BI Ming gang1，LIU Yan3
    (1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking
    Union Medical College，Beijing 100094，China; 2.Institute of information on Traditional Chinese Medicine，
    China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700；3.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029)
    【Abstract】  Objective  To evaluate the value of method for quantitation of angiogenesis in chick chorioallantoic membrane (CAM) using Image Pro Plus 5.0 software. Methods  Twenty well developed eggs were divided into two groups with 10 in each group: the Solanum nigrum group treated with 10 μL of its water extract，and the control group applied with the same volume of distilled water，respectively，absorbed on a piece of filter paper. Image Pro Plus 5.0 imaging software was used to quantify the angiogenesis with the vascular area，the total CAM area under the egg shell opening，the ratio between vascular and CAM area. Results  Image Pro Plus 5.0 software could be used to delineate and calculate the angiogenesis area and CAM area under the open egg shell window automatically and accurately. The angiogenesis was significantly reduced in the Solanum nigrum treated CAM compared with that in control group (P<0.001). Conclusion  Image Pro Plus 5.0 is an effective tool for evaluation of angiogenesis in CAM models．The percentage of angiogenesis area vs. CAM area can be used to reflect angiogenesis in CAM models simply and quatitatively.
    【Key words】  Image analysis，Software，Image Pro Plus 5.0; Quantitation，angiogenesis; Model，Chick chorioallantoic membrane
    鸡胚尿囊膜 (chick chorioallantoic membrane，CAM) 血管新生模型已成为研究抑制和促进血管新生物质的作用效果的经典手段之一。通过众多的研究者的不断改良，造模方法渐趋完善。但是，在判定CAM上新生血管的面积方面，出现了数种方法并存的局面。为了寻求一种快速、准确，易于操作的方法，我们应用广泛使用的Image Pro Plus (版本5.0) 图像处理和分析软件，对于CAM模型中的血管面积定量方法进行了研究。
1  材料和方法
    1.1  仪器
    种蛋培养箱系上海跃进医疗器械厂生产，实验室用超净工作台系苏州净化设备厂生产，ImagePro Plus 5.0软件为Media Cybernetics公司出品。
    1.2  受精种蛋 
    购于中国农业大学实验动物研究所，每只55～65 g。
    1.3  测试药物
    取龙葵茎叶100 g，以沸水浸泡提取3次，每次用水2 L，30 min。过滤，合并提取液，于水浴上蒸发浓缩至40 mL，即得2.5 g/mL 龙葵生药的提取液。给药时离心除去沉淀，用0．45  μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。
    以定性滤纸为样品载体，用打孔器制成5 mm直径大小的纸片，灭菌冷却后于超净台内，将滤纸排列于无菌铝箔上，分别加入10 L (灭菌蒸馏水稀释，含生药20 mg) 龙葵药液，空白
对照组只加入等量灭菌蒸馏水。滤纸样品均在超净台内风干。
    1.4  CAM模型
    按参考文献方法［1］进行造模。20只发育良好的7日龄鸡胚，随机分为龙葵给药组和对照组，每组10只，将种蛋表面用酒精消毒后，在超净台内用镊子在蛋胚顶端小心戳一小口，然后剥去周围的蛋壳和壳膜，使开口约为（1.5×1.5）cm大小。小心地用微型手术镊子从气室与卵黄囊分隔处挑破气室膜，轻轻去除上层的气室膜，暴露位于气室膜下层的CAM。将载样滤纸置于CAM 和卵黄囊膜处血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续在37℃和60%的相对湿度下进行孵育48 h。
    1.5  血管新生面积统计
    孵育完毕后，去除鸡胚气室端密封的透明胶，小心地用镊子从气室端揭去周围的蛋壳，最大程度暴露CAM 便于观察和拍照。
    体视显微镜接Nikon 4500数字相机，拍摄给药部位，保存图象文件。用图像处理软件ImagePro Plus 5.0读入保存的图象，进行数据收集及计算。
    1.6  统计学方法
image pro plus    所有数据输入计算机，利用SPSS软件，根据资料要求进行方差分析。
    2  结果
    2.1  血管新生面积的定量及数据收集
    （1）将存于计算机中的数字相机所摄图像文件，用图像处理软件ImagePro Plus 5.0打开，点工具条上的Manual Measurements图标，出现Measurements对话框，鼠标点Feature下面虚框中的不规则多边形图标处，鼠标移动到图像中，在所摄鸡胚CAM图中画出准确的蛋壳开窗大小所对应的CAM部位，软件即刻算出所定义的开窗部分的面积 (图1，A和D)。（2）鼠标点工具栏处的Irregular AOI (不规则的感兴趣区域) 图标后，再以鼠标在第一步标示好的CAM位置处重叠画出相应的范围。然后，点工具栏上的Measure按钮，在弹出的下拉菜单中选取count/size项，新出现一个对话框，选择Manual手动方式，点select colors按钮，选color cube base，通过鼠标选取血管处以定义血管范围，图像软件自动为选取的血管标上颜 (图1，B和E)。关闭当前对话框，回到count/size，鼠标点对话框中的count按钮，软件就立即算出相应的血管面积 (图1，C和F)。
    2.2  ImagePro Plus 5.0对给药后CAM血管新生的面积的定量
    龙葵给药后，肉眼观察，CAM上给药载体旁边新生血管数明显减少(图2A)。而对照组可见CAM上的载体周围血管排列成车辐状生长，类似树叶的叶脉状分布，大血管和小血管都明显发育(图2B)(图1，2见彩插)。应用ImagePro Plus5.0，根据上述所示的方法进行新生血管面积定量。结果表明，给药组血管新生面积为10.78%±1.42%，对照组血管新生面积为22.78% ±1.91%。与对照组比较，给药组血管新生面积明显减少(P<0.001)(图3)。
图3  龙葵对鸡胚血管新生面积的影响。用ImagePro Plus 5.0对给药组(n=10)及对照组(n=10)血管新生面积与气室开窗部位所对应的CAM面积进行统计，分别计算百分比。数据以均值±标准误表示。*P<0.001
    3  讨论
    鸡胚尿囊膜血管新生模型由于操作简便、灵敏度高、研究成本低廉等方面的优势，在肿瘤血管新生、血管新生因子、以及抗血管新生的复合物等研究方面得到了广泛的应用［2-6］。对于鸡胚血管新生的定量，目前的研究中常采用以下3种方法：(1) 计数给药后CAM上
的血管数［7-8］；(2) 观察给药后有否产生无血管区域［3］；(3) 利用图像分析仪算出CAM上新生血管的面积，计算血管生成抑制率［10］。方法一在计数血管数时，因鸡胚新生血管密布交错，常常一条血管产生数个分枝，在计算准确性上存在问题。方法二虽较为简单和直观，但是不同样本中受试药物对血管新生的抑制程度没有进行准确的数据化。方法三是用对照组血管面积减去给药组血管面积再除以对照组血管面积，所得的百分数为血管生成抑制率。但由于每组中各样本CAM的面积不一，血管面积的计算易于产生误差。
    我们在研究中发现，虽然每只鸡胚在给药时的开窗大小以（1.5×1.5）cm为准，但要控制到每个样本相一致非常困难，因此在实验结束时每只鸡胚的开窗面积所对应的CAM面积客观上存在一定的差异。为了避免统计实验数据的误差，我们在实验结束收集数据时，采用每只鸡胚的血管面积除以蛋壳开窗处所对应的CAM总面积，计算出面积的百分比，以此数据反映药物对鸡胚血管新生的作用。在新生血管的定量研究中，数字图像分析已经用于自动定量血管新生过程中的血管密度变化［10］，但各仪器生产商所开发的图像分析系统功能各异。我们在本实验中所用的图像分析软件为ImagePro Plus 5.0版，该软件的各种版本广泛地应用于世界各地的实验室中。应用ImagePro Plus软件可自动地进行范围标记，在统计新生血管面积时可做到只对指定区域内的新生血管进行识别，避免了人为因素带来的误差。另外，该
软件的统计结果可方便地输出到微软公司的EXCEL中，具有图像分析、数据收集、数据处理的一体化功能。