地塞米松通过ROS-PI3K/AKT/GSK3β
信号通路诱导成骨细胞凋亡
徐先立1韩壮2张忠文1
1沈阳农业大学医院骨科，沈阳110866；2中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳110001
通信作者：韩壮，Email：
【摘要】目的探讨地塞米松（Dex）对成骨细胞增殖和凋亡的影响及潜在的作用机制。方法
将人成骨细胞hFOB1.19分为4组：对照组（不加药物），Dex组（300μM Dex处理48h），Dex+AA组（300μM Dex+2000μM AA处理48h）和Dex+NAC组（300μM Dex+500μM NAC处理48h）。抗坏血
酸（AA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）均为活性氧（ROS）的清除剂。检测各组细胞的增殖率、凋亡率、ROS和碱性磷酸酶（ALP）水平以及PI3K/AKT/GSK3β信号通路的活性。结果Dex的半抑制浓度（IC50）约在300μM。与对照组对比，Dex组细胞的细胞增殖率［（100.00±1.76）%比（51.47±5.62）
%］和ALP活性［（100.00±0.83）%比（69.71±7.53）%］显著降低（均P＜0.05），细胞凋亡率［（3.71±1.16）%比（18.42±3.19）%］和ROS水平［（1.49±0.37）比（4.40±1.08）］显著增加（均P＜0.05）。与Dex组对比，Dex+ AA组和Dex+NAC组细胞的细胞增殖率［（51.47±5.62）%比（89.32±6.74）%、（51.47±5.62）%比（94.58±5.01）%］和ALP活性［（69.71±7.53）%比（85.49±8.17%）、（69.71±7.53）%比（92.55±8.01）%］显著增加（均P＜0.05），细胞凋亡率［（18.42±3.19）%比（9.68±2.23）%、（18.42±3.19）%比（8.97±2.07）%］和ROS
水平［（4.40±1.08）比（2.05±0.61）、（4.40±1.08）比（1.96±0.43）］均显著降低（均P＜0.05）。与对照组对比，Dex组细胞的p-PI3K［（0.98±0.17）比（0.26±0.08）］和p-AKT相对表达量［（0.56±0.10）比（0.19±0.06）］、p-PI3K/PI3K［（1.72±0.35）比（0.43±0.10）］和p-AKT/AKT比值［（0.66±0.19）比（0.21±0.08）］均显著降低（均P＜0.05），p-GSK3β相对表达量［（0.12±0.04）比（0.49±0.09）］和p-GSK3β/GSK3β比值［（0.67±0.15）比（1.32±0.24）］均显著增加（均P＜0.05）。与Dex组对比，Dex+AA组和Dex+NAC组细胞
的p-PI3K［（0.26±0.08）比（0.76±0.12）、（0.26±0.08）比（0.80±0.12）］和p-AKT相对表达量［（0.19±0.06）比（0.38±0.11）、（0.19±0.06）比（0.42±0.08）］、p-PI3K/PI3K［（0.43±0.10）比（1.21±0.27）、（0.43±0.10）比（1.35±0.21）］和p-AKT/AKT比值［（0.21±0.08）比（0.45±0.04）、（0.21±0.08）比（0.45±0.07）］均显著增加（均P＜0.05），p-GSK3β相对表达量［
（0.49±0.09）比（0.26±0.05）、（0.49±0.09）比（0.22±0.07）］和p-GSK3β/GSK3β比值［（1.32±0.24）比（0.83±0.19）、（1.32±0.24）比（0.73±0.16）］均显著降低（均P＜0.05）。结论Dex可通过ROS-PI3K/AKT/GSK3β信号通路诱导成骨细胞凋亡。
【关键词】地塞米松；ROS-PI3K/AKT/GSK3β信号通路；成骨细胞；凋亡
Dexamethasone induces osteoblast apoptosis through ROS-PI3K/AKT/GSK3βsignaling pathway
Xu Xianli1,Han Zhuang2,Zhang Zhongwen1
1Department of Orthopedics,Hospital of Shenyang Agriculture University,Shenyang110866,China;
2Department of Orthopedics,First Hospital,China Medical University,Shenyang110001,China Corresponding author:Han Zhuang,Email:
【Abstract】Objective To investigate the effects of dexamethasone(Dex)on proliferation and apoptosis of osteoblasts and the underlying influence mechanism.Methods Human osteoblasts hFOB 1.19were divided into a control group(no drug treatment),a Dex group
DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2021.05.023
收稿日期2020-08-03本文编辑吴琴娟
引用本文：徐先立，韩壮，张忠文.地塞米松通过ROS-PI3K/AKT/GSK3β信号通路诱导成骨细胞凋亡[J].国际医药卫生导报,2021,27(5):723-727.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2021.05.024.
(treatment with300μM Dex for48h),a Dex+AA group(treatment with300μM Dex+2000μM AA for48h),and a Dex+NAC group(treatment with300μM Dex+500μM NAC for48h).Ascorbic acid (AA)and N-acetyl-L-cysteine(NAC)were scavengers of ROS.The proliferation rates,apoptotic rates, levels of reactive oxygen species(ROS)and alkaline phosphatase(ALP),and the activity of PI3K/ AKT/GSK3βsignaling pathway were examined in all the four groups.Results The half-inhibitory concentration(IC50)of Dex was about300μM.The cell proliferation rate and ALP activity were significant
ly lower and the apoptotic rate and ROS level were significantly higher in the Dex group than in the control group[(51.47±5.62)%vs.(100.00±1.76)%,(69.71±7.53)%vs.(100.00±0.83)%, (18.42±3.19)%vs.(3.71±1.16)%,and(4.40±1.08)vs.(1.49±0.37);all P＜0.05].The cell proliferation rate and ALP activity were higher and the apoptotic rate and ROS level were lower in the Dex+AA group and the Dex+NAC group than in the Dex group[(89.32±6.74)%and(94.58±5.01)%vs.
(51.47±5.62)%,(85.49±8.17)%and(92.55±8.01)%vs.(69.71±7.53)%,(9.68±2.23)%and(8.97±2.07)%vs.(18.42±3.19)%,and(2.05±0.61)and(1.96±0.43)vs.(4.40±1.08);all P＜0.05].The relative expression levels of p-PI3and p-AKT,p-PI3K/PI3K,and p-GSK3β/GSK3βwere higher and the relative expression of p-GSK3βand p-GSK3β/GSK3βwere lower in the control group than in the Dex group[(0.57±0.13)vs.(0.26±0.08),(0.56±0.10)vs.(0.19±0.06),(1.72±0.35)vs.(0.43±0.10), (0.66±0.19)vs.(0.21±0.08),(0.12±0.04)vs.(0.49±0.09),and(0.67±0.15)vs.(1.32±0.24);all P＜0.05].The relative expression levels of p-PI3K and p-AKT,p-PI3K/PI3K,and p-AKT/AKT were lower and the relative expression of p-GSK3βand p-GSK3β/GSK3βwere higher in the Dex group than in the Dex+AA group and the Dex+NAC group[(0.26±0.08)vs.(0.76±0.12)and(0.80±0.12),(0.19±0.06)vs.(0.38±0.11)and(0.42±0.08),(0.43±0.10)vs.(1.21±0.27)and(1.35±0.21),(0.21±0.08)vs.
(0.45±0.04)and(0.45±0.07),(0.49±0.09)vs.(0.26±0.05)and(0.22±0.07),(1.32±0.24)vs.(0.83±0.19)and(0.
73±0.16);all P＜0.05].Conclusion Dex can induce osteoblast apoptosis via the ROS-PI3K/AKT/GSK3βsignaling pathway.
【Key words】Dexamethasone;ROS-PI3K/AKT/GSK3βsignaling pathway;Osteoblasts; Apoptosis
骨坏死是一种比较常见的骨科疾病，指由于循环障碍导致的骨细胞和骨髓细胞缺血性死亡［1］。糖皮质激素（GCs）是广泛用于炎症或自身免疫性疾病的药物，包括关节炎、系统性红斑狼疮和严重过敏反应［2］。近年来，大量研究表明过量使用GCs会抑制成骨细胞增殖并促进其凋亡，从而导致患者发生非创伤性骨坏死［3-4］。长期接受GCs 的患者骨折发生率为30%～50%［5］。因此，探讨GCs介导的成骨细胞增殖和凋亡的分子机制至关重要，这可能有助于开发缓解GCs诱导骨坏死的有效方法。Dex是一种人工合成的糖皮质激素，可用于红斑狼疮、牛皮癣、过敏性疾病和慢性阻塞性肺疾病等多种疾病［6］。Sato AY 等［7］的研究指出活性氧/内质网应激（ROS/ER）与Dex诱导的成骨细胞和骨细胞凋亡有关。但仍需更多的研究来进一步探索Dex诱导成骨细胞凋亡的分子机制。在本研究中，我们旨在研究ROS在Dex诱导的成骨细胞凋亡中的作用，为进一步了解Dex诱导成骨细胞凋亡的分子机制提供可能的思路，并为减轻Dex诱导的成骨细胞损伤和骨坏死提供可能的靶标。
1材料与方法
1.1细胞培养人成骨细胞株hFOB1.19购自美国ATCC细胞保藏中心。hFOB1.19细胞为人胚永生化成骨细
胞系，是将SV40LT抗原基因转染入自然流产的胎儿组织中使其获得永生化的，与人成骨细胞具有高度同源性，是评价药物影响骨代谢的最佳细胞模型。将细胞培养在Ham's F12和DMEM1∶1的混合培养基（含10%胎牛血清）中，常规培养。
1.2细胞干预及分组细胞经0.25%胰蛋白酶（上海第一生化药业有限公司生产，规格：
2.5万U）消化后，调整细胞密度为5×103个/ml，每孔200μl种植于96孔板中，培养24h后吸弃培养液，加入0、1、5、25、50、100、200和300μM 的Dex（美国Sigma-Aldrich公司），加入培养基至200μl，每组设4个复孔，于37℃、5%CO2的培养箱中培养48h，之后采用MTT法检测细胞增殖率。
为检测ROS在Dex影响成骨细胞增殖及凋亡中的作用，我们采用ROS的清除剂抗坏血酸（AA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理Dex（广东华南药业集团有限公司生产，规格：075mg）干预后的成骨细胞，AA和NAC均购自美国Sigma-Aldrich公司。基于此，将hFOB1.19分为4组：对照组，Dex组，Dex+AA组和Dex+NAC组。对照组：不加药物，只培养48h；Dex组：细胞采用300μM的Dex处理48h。Dex+AA组：细胞中同时加入300μM的Dex及2000μM的AA，培养48h。Dex+NAC组：细胞中同时加入300μM的Dex及500μM的NAC，培养48h。
1.3细胞增殖率检测将5×103个/ml密度的细胞以每孔200μl种植于96孔板中，细胞干预及分组同1.2部分，均以只含有培养基的孔为空白孔。处理48h后每孔加入10μl的CCK-8溶液，于37℃孵育1h，用酶标
仪在450nm处检测吸光值（OD）。细胞增殖率（%）=
（OD
试验组-OD空白组）/OD空白组×100%。
1.4细胞凋亡率检测细胞分组同1.2部分，培养48h
后用PBS洗3次。然后将100μl的细胞加入至100μl的FITC-Annexin V/PI检测液中，避光室温孵育30min。之后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.5ROS水平检测细胞分组同1.2部分，培养48h 后用PBS洗3次，然后用10μM的DCFH-DA于37℃避光孵
育30min，之后采用流式细胞仪检测平均荧光强度。活性氧检测试剂盒购自上海碧云天公司，严格按照试剂盒操作。
1.6碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞分组同1.2部分，培养48h后。取10μl的细胞加入96孔板中，用碱性
磷酸酶检测试剂盒（上海碧云天公司）中的显底物调整体积至50μl，摇晃均匀，于37℃孵育10min。之后每孔加入100μl 的反应终止液，用酶标仪在405nm处检测吸光值。ALP活性单位的定义为：在pH9.8的二乙醇胺（DEA）缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解对硝基苯磷酸二钠显底物产生1μmol 对硝基苯酚所需的ALP的量定义为一个酶活力单位，也称为一个DEA酶活力单位。ALP活性（%）=ALP活性单
位
给药组/ALP活性单位对照组×100%。
1.7Western Blot细胞分组同1.2部分，培养48h后采用RIPA裂解液提取各组细胞中的总蛋白，BCA试剂盒对总蛋白定量。将20μg的总蛋白加入至上样缓冲液中，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白，之后将总蛋白转至PVDF 膜上。采用3%胎牛血清封闭45min后，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗3次。孵育二抗，室温摇床孵育1h，TBST洗3次。用电化学发光试剂（ECL）于暗室发光。凝胶成像系统和Image J软件收集处理分析条带，GAPDH为内参。1.8统计学分析所有数据采用均数±标准差表示，符合正态分布，数据采用SPSS2
2.0软件进行统计学分析。多组建比较采用单因素方差分析，LSD多重比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1Dex对成骨细胞增殖和凋亡的影响如图1所示，与0μM的Dex对比，100μM、200μM和300μM的Dex可显著抑制成骨细胞的细胞增殖率（均P＜0.05）。而且Dex的半抑制浓度（IC50）约在300μM，因此我们选择300μM的Dex应用于后续的试验。如表1所示，与对照组对比，Dex组细胞的细胞增殖率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。与Dex组对比，Dex+AA组和Dex+NAC组细胞的细胞增殖率显著增加（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。
2.2Dex对成骨细胞中ROS和ALP水平的影响如表2所示，与对照组对比，Dex组细胞的ROS水平显著增加（P ＜0.05），ALP活性显著降低（P＜0.05）。与Dex组对比，Dex+AA组和Dex+NAC组细胞的ROS水平显著降低（均P＜0.05），ALP活性显著增加（均P＜0.05）。
2.3Dex对成骨细胞中PI3K活性的影响如表3所示，与对照组对比，Dex组细胞的p-PI3K相对表达量和p-PI3K/PI3K比值显著降低（P＜0.05）。与Dex组对比，Dex+AA组和Dex+NAC组细胞的p-PI3K相对表达量和p-PI3K/PI3K比值显著增加（P＜0.05）。各组间PI3K相对表达量对比差异无统计学意义。
2.4Dex对成骨细胞中AKT活性的影响如表4所示，与对照组对比，Dex组细胞的p-AKT相对表达量和p-AKT/AKT比值显著降低（P＜0.05）。与Dex组对比，Dex+ AA组和Dex+NAC组细胞的p-AKT相对表达量和p-AKT/ AKT比值显著增加（P＜0.05）。各组间AKT相对表达量对比差异无统计学意义。
表3各组细胞中PI3K活性对比（-x±s）组别
对照组
Dex组
Dex+AA组
Dex+NAC组
F值
P值
PI3K相对
表达量
0.57±0.13
0.62±0.16
0.63±0.11
0.59±0.14
0.16
0.92
p-PI3K相对
表达量
0.98±0.17
0.26±0.08a
0.76±0.12b
0.80±0.12b
23.76
<0.001
p-PI3K/PI3K
1.72±0.35
0.43±0.10a
1.21±0.27b
1.35±0.21b
18.89
<0.001
注：与对照组对比，a P＜0.05；与Dex组对比，b P＜0.05
表2各组细胞中ROS和ALP水平对比（-x±s）组别
对照组
Dex组
Dex+AA组
Dex+NAC组
F值
P值
荧光强度
1.49±0.37
4.40±1.08a
2.05±0.61b
1.96±0.43b
14.68
0.003
ALP活性（%）
100.00±0.83
69.71±7.53a
85.49±8.17ab
92.55±8.01b
14.09
0.002
注：与对照组对比，a P＜0.05；与Dex组对比，b P＜
0.05
图1Dex对成骨细胞增殖率的影响
表1各组细胞增殖率和细胞凋亡率对比（-x±s，%）
组别
对照组
Dex组
Dex+AA组
Dex+NAC组
F值
P值
细胞增殖率
100.00±1.76
51.47±5.62a
89.32±6.74b
94.58±5.01b
44.82
＜0.001
细胞凋亡率
3.71±1.16
18.42±3.19a
9.68±2.23ab
8.97±2.07ab
28.61
＜0.001注：与对照组对比，a P＜0.05；与Dex组对比，b P＜0.05
2.5Dex 对成骨细胞中GSK3β活性的影响如表5所
示，与对照组对比，Dex 组细胞的GSK3β相对表达量、p-GSK3β相对表达量和p-GSK3β/GSK3β比值均显著增加
（P ＜0.05）。与Dex 组对比，Dex+AA 组和细胞的p-GSK3β相对表达量和p-GSK3β/GSK3β比值显著降低（P ＜0.05），GSK3β相对表达量无显著变化。
3讨论
骨坏死是一种严重的退化性骨疾病，与成骨细胞凋亡有关［1］。成骨细胞是一种骨形成细胞，在骨生成和预防骨坏死中起关键作用［8］。GCs 的使用已成为骨坏死的最常见原因［3］。先前的研究已经证明，Dex 对成骨细胞具有抑制作用，原因与其对成骨细胞的细胞增殖和细胞凋亡的作用有关［9］。在本研究中，我们发现100μM 、200μM 和300μM 的Dex 作用48h 可显著抑制成骨细胞hFOB 1.19的细胞
增殖，且Dex 的IC 50约在300μM ，因此我们选择300μM 的Dex 应用于后续的试验。结果还发现，300μM 的Dex 作用48h
可显著促进成骨细胞的凋亡。这些结果及研究均表明，Dex 可抑制成骨细胞的增肌，并促进其凋亡。
过量的ROS 在诱导各种细胞凋亡中具有重要的作用
［10］
。过量的ROS 产生将导致细胞内ROS 压力增加，然后
破坏细胞中的脂质、蛋白质和DNA 的结构和功能，从而通过线粒体介导的caspase 凋亡途径导致细胞凋亡［11］。Sato AY 等［7］的研究证明ROS 应激的增加参与Dex 诱导的成骨细胞OB-6凋亡。在研究中，我们发现Dex 可显著增加成骨细
胞中ROS 的水平约3倍，推测这可能是Dex 诱导成骨细胞凋亡的机制。因此之后我们采用ROS 的清除剂NAC 或AA 与Dex 同时处理成骨细胞，结果表明NAC 或AA 均可降低Dex 诱导的ROS 的产生，验证了NAC 或AA 对ROS 的清除效果。
此外，我们还发现NAC 或AA 可增加Dex 诱导的成骨细胞增殖，并抑制Dex 诱导的成骨细胞凋亡。这些结果进一步证实，Dex 对成骨细胞的促凋亡作用是通过过量ROS 的产生介导的。
ALP 可使局部钙、磷的浓度升高，并在胶原原纤维内沉
积，对矿物质化机制的进行具有有利的作用，是促进骨间质矿化的重要酶。目前认为ALP 活性是反映成骨细胞成熟状
态的重要标志之一［12］。本研究结果显示，与对照组对比，Dex 组细胞的ALP 活性显著降低。与Dex 组对比，Dex+AA 组和Dex+NAC 组细胞的ALP 活性显著增加。这些结果表明，Dex 可降低成骨细胞的活性，而在Dex 诱导的成骨细胞中加入ROS 清除剂后可显著增加成骨细胞的活性，进一步表明ROS 在Dex 抑制成骨细胞活性中的重要作用。目前已经发现磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶3（PI3K/
AKT ）信号通路参与细胞增殖、分化、侵袭和凋亡相关的多种信号转导通路［8］。Ma P 等［13］的研究指PI3K/AKT 信号通
路的激活是大鼠成骨细胞增殖和分化的必要条件。在本研究中，我们还发现Dex 处理可下调成骨细胞hFOB 1.19中
p-PI3K 和p-AKT 的表达，而NAC 或AA 可逆转Dex 诱导的成骨细胞中PI3K/AKT 信号通路的失活。这些结果证实了Dex 通过抑制PI3K/AKT 信号传导途径诱导成骨细胞凋亡，
并且ROS 应激的增强在Dex 诱导成骨细胞中PI3K/AKT 信号通路的失活中起重要作用。
糖原合成酶激酶3β（GSK3β）最初被认为是糖原代谢的调节剂［14］。GSK3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，可以调节能量代谢、细胞生长和细胞凋亡［15］。此外，GSK3β是PI3K/AKT 的关键下游底物和效应子［16］。在我们的研究中发现，Dex 可增加成骨细胞中GSK3β的活性，而NAC 或AA
可逆转Dex 诱导的成骨细胞中GSK3β活性的增加。由于已经表明GSK3β是PI3K/AKT 的关键下游底物，因此我们可以得出结论，Dex 通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路促进成骨细胞凋亡，并且ROS 在其中起重要的调控作用。
本研究还具有一些不足之处，例如缺少动物实验的活体内研究，以及并未做信号通路的阻断实验等等，这些将是下一步研究要解决的问题。
总之，本研究表明Dex 可通过ROS-PI3K/AKT/GSK3β信号通路诱导成骨细胞凋亡，并建议ROS 可能是Dex 诱导的成骨细胞凋亡的或预防靶标。另外，仍需进一步的体内研究以验证本研究中的发现。
利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。
参
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表5
各组细胞中GSK3β活性对比（-x ±s ）
组别对照组Dex 组Dex+AA 组Dex+NAC 组
F 值P 值
GSK3β相对表
达量0.18±0.05
0.37±0.06a 0.31±0.080.30±0.066.290.008p-GSK3β相对
表达量0.12±0.04
0.49±0.09a 0.26±0.05ab 0.22±0.07b 22.92
＜0.001p-GSK3β/
GSK3β0.67±0.15
1.32±0.24a 0.83±0.19b 0.73±0.16b
9.87
0.002注：与对照组对比，a P ＜0.05；与Dex 组对比，b
P ＜0.05
表4
各组细胞中AKT 活性对比（-x ±s ）
组别对照组Dex 组Dex+AA 组Dex+NAC 组
F 值P 值
AKT 相对表达量0.85±0.210.86±0.190.88±0.230.94±0.160.160.92
p-AKT 相对表达量0.56±0.10
0.19±0.06a
0.38±0.11b 0.42±0.08b
11.610.007
p-AKT/AKT 0.66±0.19
0.21±0.08a
0.45±0.04b 0.45±0.07b
11.040.001
注：与对照组对比，a P ＜0.05；与Dex 组对比，b
P ＜0.05
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平肝健脾汤对青光眼患者房水中MMP-2及TIMP-2表达的影响
李小化1
范江华2
1
海阳市人民医院中医眼科265100；2
海阳市人民医院门诊部预防保健科
265100
通信作者：范江华，Email ：***********************
【摘要】目的
探讨平肝健脾汤青光眼的疗效及对房水基质金属蛋白酶2（MMP-2）及其组
织抑制剂-2（TIMP-2）表达的影响。方法
选取2018年10月至2020年1月本院收治的126例
（131眼）青光眼患者，采用随机数字法分成两组，对照组63例（65眼）行常规西医药物，观察组63例（66眼）在对照组的基础上加用自拟平肝健脾汤，观察两组眼压、视野缺损情况及房水中MMP-2、TIMP-2的变化。结果
两组前眼压比较差异无统计学意义（P ＞0.05），随时间延长，两组患
者眼压均降低（F =5.862，P =0.017），两组组间眼压比较，差异有统计学意义（F =4.881，P =0.040）
，且两组眼压组间、时点间交互作用比较，差异有统计学意义（F =5.841，P =0.026）；后8周两组AGIS 评分较前均呈显著降低（均P ＜0.05），后8周观察组AGIS 评分为（5.84±1.20）分，明显低于对照组的（6.01±1.44）分，差异有统计学意义（P ＜0.05）；后8周两组房水MMP-2、TIMP-2及
MMP-2/
DOI ：10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2021.05.024收稿日期2020-07-03
本文编辑吴琴娟
引用本文：李小化，范江华.平肝健脾汤对青光眼患者房水中MMP-2及TIMP-2表达的影响[J].国际医药卫生导报,2021,27(5):727-730.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2021.05.025.
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