简单实验步骤如下:
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后，自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min＊3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2＊5min
6.羊血清封闭：３７度，２０分钟
７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时
８.４度PBS洗净，３min＊５次
９.二抗３７度小于一小时
１０.３７度PBS洗净，３＊５min
凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）
活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×10６～１×10７／ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
视细胞浓度加入100～500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5～7天)
（二）试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g  蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４ 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度5％)
4％NaN３50ml (终浓度0.2％)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖20g (终浓度2％)
甲醛10ml
NaN３0.2g (终浓度0.02％)
我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，
避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间
仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
直接免疫荧光法测抗原
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器
●磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
●荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
●缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
●搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
●有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
●荧光显微镜
●玻片架
●滤纸
●37℃温箱等。
实验步骤
1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项
1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2.染的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染时间。低温染过夜较37℃30 min效果好的多。
3.为了保证荧光染的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染的干扰。
（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
（3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染。
4.一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
间接免疫荧光法测抗体
基本原理
染程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
试剂与仪器
●磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
●缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
●荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。
●搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
●有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
●荧光显微镜
●玻片架
●滤纸
●37℃温箱等。
实验步骤
1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
2.滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
3.取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS
三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5.将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
6.重复操作3。
7.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
8.荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。
注意事项
1.荧光染后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2.每次试验时，需设置以下三种对照：
（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物
（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物
（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3.已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染。
1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？
参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染方法是一样的。
2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？
参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是：
（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
（2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
（3）我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
（4）封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：
（1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行？
（2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片？
37度
（3）免疫酶染中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？
参考见解：
（1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；
（2）封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；
（3）关于免疫酶染，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶；2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
4、问：做间接法免疫荧光染，如何设置对照？
参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染。
（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问：我做乳腺组织的免疫荧光染，结果用激光共聚焦显微镜看很好：有阳性信号，阴性对照组也
没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染，到底哪个结果才是真实的呢？
参考见解：激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。
免疫荧光技术基本原理（图）
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术（Immunofluorescence technique），又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、
生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的
方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
1．原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧
光素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
2．技术分类：
⑴荧光抗体技术（荧光显微镜技术）
抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
⑵免疫荧光测定技术：
抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
（1）荧光物质
1）荧光素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光素或荧光染料。常用的荧光素有：
(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄或橙黄结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿荧光，结构式如下：