DNA条形码技术在海马物种鉴定中的应用分析
曾韵颖陈信忠*朱黄鑫龚艳清郭书林叶鹏
（厦门海关技术中心，福建厦门361026）
摘要海马具有重要的药用和观赏价值，但因其可供鉴定的形态特征较少，应用形态学对海马进行种水平的鉴定时经常会遇到很多困难。DNA条形码技术为海马物种鉴定提供了重要的鉴定方法。通过检索生命条形码数据库（BOLD）和GenBank数据库中海马的DNA条形码信息，应用MEGA软件计算海马种间遗传距离，分析
DNA条形码在海马物种鉴定中的应用效果。结果表明，COI基因条码可以有效鉴别大部分种以上阶元的海马，但对亲缘关系较近的海马难以获得准确的鉴定结果。还有一些海马尚无相关的基因信息，也无法通过基因条形码进行鉴别。因此，应用DNA条形码鉴定海马物种尚有一定的局限性。
关键词海马；DNA条形码；物种鉴定；基因信息
中图分类号S917.4文献标识码A
文章编号1007-5739（2023）16-0176-05
DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.16.044开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Application Analysis of Identification of Seahorse Species Based on DNA
Barcoding Technology
ZENG Yunying CHEN Xinzhong*ZHU Huangxin GONG Yanqing GUO Shulin YE Peng
(Xiamen Customs Technology Center,Xiamen Fujian361026)
Abstract Seahorse has important medicinal and ornamental value,but due to the limited morphological features available for identification,there are often many difficulties in using morphology for species level identification of seahorses.DNA barcoding technology provides an important method for species identification of seahorse.By searching the DNA barcoding information of seahorse in BOLD and GenBank databases,MEGA software was used to calculate the genetic distance between seahorse species,and the application effect of DNA barcoding in seahorse species identification was analyzed.The results showed that the COI gene barcode could effectively identify most of the above-mentioned seahorse,but it was difficult to obtain accurate identification results for the seahorse with close genetic relationship. There are also some seahorse that have no relevant genetic information and cannot be identified by gene barcoding. Therefore,there are still some limitations in the application
of DNA barcoding to identify seahorse species.
Keywords seahorse;DNA barcoding;species identification;gene information
海马是一种形态特殊的小型海洋鱼类，主要分布于温带至热带海域，生活方式较隐秘，主要栖息于河口和珊瑚礁等。海马是重要的中药材，具有补肾壮阳、活血止痛等功效。近年来，海马还成为水族爱好者的观赏珍品。因过度捕捞，很多野生海马种在世界范围内锐减，甚至成为濒危物种。2019年世界自然保护联盟颁布的《濒危野生动植物种国际贸易公约》将海马属（Hippocampus spp.）所有物种列入濒危物种红名录，严格管制其国际贸易。海马种类多，形态十分相似，已有文献报道的海马约有54个有效种[1]。因不同种类海马的药用价值和欣赏价值存在较大差异，中药材市场存在很多掺假现象，严重影响海马药材的质量和安全，因而需要对海马物种进行准确的鉴定。传统的形态学鉴别方法主要依据海马的形态、体和斑纹等特征，容易受环境和年龄等因素的影响，商品海马多为干制品或粉状制品，更难以进行形态学鉴别。因此，需要建立更加准确的物种鉴别方法。
近年来，DNA条形码技术为物种鉴定提供了基因
基金项目厦门海关课题（2021XK06）。
第一作者曾韵颖（1984—），女，兽医师，从事动物检疫工作。E-mail：***************
*通信作者E-mail：133****************
收稿日期2022-11-24
176
水平的鉴定方法。其中，生命条形码数据库（barcode of life data systems，BOLD）采用经过权威分类鉴定的标本，根据线粒体细胞素氧化酶I（COI）构建了含有DNA条形码、形态图和地理分布的全球物种参考标准数据库。该系统首先在鱼类物种鉴定中广泛应用，解决了传统形态学方法难以鉴别的难题，可以有效鉴别大部分鱼类。美国国家生物技术信息中心（NCBI）创建的基因库（GenBank）收录了大量物种基因，包括常用于物种鉴定的COI、16S rRNA、细胞素b（Cytb）等DNA条形码信息。应用这些基因信息可以对大部分物种进行鉴定。但由于对海马的研究相对较少，收录的基因条码信息有限，尚有很多物种缺乏基因条码数据。此外，一些亲缘关系相近的海马基因序列十分相似，该技术的应用还有一定的局限性。因此，通过分析DNA条形码对海马物种鉴别的应用，可以了解该技术的优势和存在的不足。
1研究方法
通过检索GenBank和BOLD等数据库中海马属动物的线粒体、COI、16S rRNA、Cytb等基因信息，应用
MEGA11.0软件，构建海马的邻接法（N-J法）系统发育树，计算种内或种间遗传距离。根据BOLD数据库中海马种内和种间遗传距离，结合系统发育树，判断DNA基因条码的分辨力。根据相关海马的分类结果，判断DNA条形码在豆丁海马以及海马复合体物种鉴别中的应用价值。
2结果与分析
2.1GenBank收录的海马基因信息
到目前为止，NCBI已经收录了40种海马的基因信息，包括海马基因组全序列、线粒体全序列以及COI、16S rRNA、Cytb等基因序列的信息（表1）。相对其他常见的水生动物物种，海马基因组学的研究相对较少，很多海马的基因信息不够完整，大部分海马只有少数样本的基因数据。至今GenBank尚有10多种海马无任何基因信息。低冠海马（Hippocampus dahlia）在GenBank中无任何序列，但BOLD收录了COI序列，可以将其与其他海马完全分开。
表1GenBank收录的海马基因序列
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
物种
日本海马（Hippocampus mohnikei）
管海马（Hippocampus kuda）
三斑海马（Hippocampus trimaculatus）
克氏海马（Hippocampus kelloggi）
棘海马（Hippocampus spinosissimus）
欧洲海马（Hippocampus hippocampus）
驼背海马（Hippocampus camelopardalis）
巴氏豆丁海马（Hippocampus bargibanti）
西澳海马（Hippocampus subelongatus）
南非海马（Hippocampus capensis）
昆士兰海马（Hippocampus queenslandicus）
吻海马（Hippocampus reidi）
小海马（Hippocampus zosterae）
膨腹海马（Hippocampus abdominalis）
西非海马（Hippocampus algiricus）
非洲豆丁海马（Hippocampus nalu）
贾氏海马（Hippocampus jayakari）
虎尾海马（Hippocampus comes）
线纹海马（Hippocampus erectus）
太平洋海马（Hippocampus ingens）
刺海马（Hippocampus histrix）
鲍氏海马（Hippocampus barbouri）
花海马（Hippocampus sindonis）
棕海马（Hippocampus fuscus）
怀氏海马（Hippocampus whitei）
长吻海马（Hippocampus guttulatus）
彭氏豆丁海马（Hippocampus pontohi）
丹尼斯豆丁海马（Hippocampus denise）
线粒体全序列
4
4
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
COI
254
92
151
58
87
6
生活中常见的数据库应用2
4
2
2
4
51
4
3
2
3
2
77
31
78
29
74
9
37
5
20
10
16S rRNA
5
58
28
6
8
24
4
4
3
3
2
9
5
5
4
2
2
9
16
5
2
11
5
2
2
7
1
1
Cytb
256
217
191
12
98
9
5
2
3
5
2
54
4
17
5
2
2
15
122
2
10
34
4
20
2
127
单位：条
177
2.2BOLD收录的海马COI基因条形码BOLD是全球DNA条形码的应用数据库，支持所有生命条形码数据的产生和应用。目前，该系统已收集有基因条码的标本数量为338825个。物种级的条形码记录有4676863条序列，涵盖241292个物种。已收录的海马COI基因条形码中，有记录的标本数量为2322个，有序列的标本数量为2280个，有基因条码的标本数量为2254个，涵盖物种数量100种，其中59种为海马属的未定种。有COI基因条形码的物种数量92种，包括38种有效种，涵盖了目前国际上大部分海马种类。
基因序列差异越大，表示遗传距离越大，系统发育树上的亲缘关系越远。物种间的遗传距离通常大于2%，
即当同一个基因序列的差异大于2%时，才能被认为属于不同的物种。因此，根据BOLD现有资料，有24种海马与最接近的物种的遗传距离大于2%，可以依据COI基因条码进行有效的鉴别（表2）。9种海马因为其种间距离小于2%，无法根据COI基
表1（续）
序号29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
物种
费雪氏海马（Hippocampus fisheri）
巴塔哥尼亚海马（Hippocampus patagonicus）
窄腹海马（Hippocampus angustus）
东方多棘海马（Hippocampus hendriki）
双斑海马（Hippocampus biocellatus）
日本豆丁海马（Hippocampus japapigu）
韩国海马（Hippocampus haema）
高冠海马（Hippocampus coronatus）
短头海马（Hippocampus breviceps）
多枝海马（Hippocampus ramulosus）
夏威夷海马（Hippocampus hilonis）
短吻海马（Hippocampus casscsio）
线粒体全序列
COI
2
7
3
5
2
1
16S rRNA
2
20
5
1
1
Cytb
10
5
26
6
1
6
3
单位：条表2BOLD可准确鉴定的海马基因条码相关信息
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
物种
非洲豆丁海马（Hippocampus nalu）
驼背海马（Hippocampus camelopardalis）
短头海马（Hippocampus breviceps）
膨腹海马（Hippocampus abdominalis）
小海马（Hippocampus zosterae）
巴氏豆丁海马（Hippocampus bargibanti）
贾氏海马（Hippocampus jayakari）
丹尼斯豆丁海马（Hippocampus denise）
长吻海马（Hippocampus guttulatus）
彭氏豆丁海马（Hippocampus pontohi）
日本海马（Hippocampus mohnikei）
双斑海马（Hippocampus biocellatus）
巴塔哥尼亚海马（Hippocampus patagonicus）
刺海马（Hippocampus histrix）
鲍氏海马（Hippocampus barbouri）
克氏海马（Hippocampus kelloggi）
棘海马（Hippocampus spinosissimus）
低冠海马（Hippocampus dahlia）
怀氏海马（Hippocampus whitei）
费雪氏海马（Hippocampus fisheri）
虎尾海马（Hippocampus comes）
欧洲海马（Hippocampus hippocampus）
太平洋海马（Hippocampus ingens）
三斑海马（Hippocampus trimaculatus）
条形码编号
AEG4447
AAX0875
AAI8275
AAE5343
AAK6087
ADW8652
ADR2646
ADL4783
AAF0610
AAX1234
AAF0669
AAI8269
AAD3204
AAE5355
AAI8263
AAF0667
AAE5353
AAX1232
AAI8253
AAI8262
AAF0615
AAZ6366
AAF0678
AAD9015
公开条形码
记录/条
1
19
3
9
182
3
2
11
5
21
255
2
13
27
87
65
137
1
39
2
84
5
75
203
平均距离/
%
0.39
0.43
0.71
0.97
0.21
0.42
0.19
0.21
0.37
0.31
0.19
0.14
0.27
0.34
1.01
0.19
0.92
0.21
0.53
0.21
0.34
最大距离/
%
1.99
0.64
1.30
3.25
0.31
1.76
0.48
0.81
3.54
0.31
0.62
0.72
1.13
4.28
2.92
1.12
0.92
0.81
1.30
1.30
2.27
最接近物种
距离/%
15.09
11.74
11.83
11.40
10.60
10.54
9.31
8.71
8.80
8.43
7.96
6.65
6.26
6.12
6.10
5.73
5.73
4.86
4.82
3.20
2.59
2.42
2.40
2.21
178
因条码进行准确的鉴别，包括管海马（Hippocampus kuda）、窄腹海马（Hippocampus angustus）、西澳海马
（Hippocampus subelongatus）、线纹海马（Hippocampus erectus）、东方多棘海马（Hippocampus hendriki）、南非海
马（Hippocampus capensis）、棕海马（Hippocampus fuscus）、
西非海马（Hippocampus algiricus）和吻海马（Hippocam-pus reidi）。其中，东方多棘海马被认为是窄腹海马的
同物异名[2]。另外，昆士兰海马（Hippocampus queens-landicus）被认为是棘海马（Hippocampus spinosissimus）
的同物异名[2]。Hou等[3]测定了昆士兰海马线粒体基因全序列，与棘海马线粒体基因全序列的同源性达98%，COI和16S rRNA基因的同源性更超过99%，也表明与棘海马的亲缘关系非常近。但至今尚有10余
种海马无COI基因信息，无法评估其鉴定效果。
2.3基因条码鉴别豆丁海马
豆丁海马又称侏儒海马，是对体型很小的一类海
马的总称，成体一般不大于2.5cm。豆丁海马通常具
有良好的保护和很强的伪装本能，可以根据各自寄
居珊瑚的形态而变成不同的拟态。其身上有肉瘤状突
起物，体鲜亮，是海中彩最为鲜艳的几种生物之
一，已发现的体有红灰、黄、白几种，近年来不断有
新种的报告。根据形态学特征和COI序列分析，日本
发现了新种日本豆丁海马（Hippocampus japapigu）[4]，在我国台湾省发现了5种豆丁海马[5]。南非的非洲豆丁海马（Hippocampus nalu）的COI基因与形态相似的日本豆丁海马、彭氏豆丁海马也有显著的遗传差异[6]。
至今已报告的豆丁海马有9种，其中非洲豆丁海
马、彭氏豆丁海马、巴氏豆丁海马和丹尼斯豆丁海马
已在BOLD收录了条码，并可进行有效鉴别。日本豆
丁海马目前只有在GenBank中登录了COI基因信息，
通过BLASTn结果其COI序列与其余已知豆丁海马
的相似性均小于95%。因此，可以利用COI基因进行
有效鉴定。至今基因库中尚无克里蒙氏豆丁海马、萨
托米豆丁海马、华伦氏豆丁海马和赛氏豆丁海马（Hip-pocampus severnsi）等豆丁海马的基因信息，因而无法应用基因条码进行鉴定。
2.4基因条码鉴别管海马复合体
管海马又称大海马，其质地光滑、干燥后肤白
净，是海马中个体较大、药用价值较高的物种，被《中
华人民共和国药典》列为5种药用海马之一[7]。管海马也是目前人工养殖和水族观赏的重要品种。管海马分布十分广泛，在太平洋和印度洋许多国家沿海均有发现。目前，已将161个已测序的管海马标本分为3个BINS，分别为AAC0510、AAC0512和ACE6993，种内平均差异为0.46%，最大差异达2.52%。因为管海马与同地区的棕海马、西非海马、南非海马和吻海马等多种海马的基因序列同源性很高，采用COI和16S rRNA基因均无法有效区分种类，所以常被称为管海马复合体[8-9]。这些海马的系统发育树见图1。
根据COI基因系统发育树和遗传距离测试结果，这5种管海马复合体亲缘关系很近，平均遗传距离为0.019。目前，针对管海马复合体的分类尚有争议。部分管海马复合体不仅基因相似，形态特征也十分相似，可能存在同物异名的现象。因棕海马和留尼旺海马（Hippocampus borboniensis）等在形态学、遗传学或地理学上与管海马十分相似，因而将棕海马等14种海马归为管海马的同物异名[2]。也有学者认为，虽然遗传距离很小，但因为地理上的巨大差异，一些种类已经具有不同的形态特征，如西非海马分布于西非大西洋的中东部海岸，吻海马分布于美洲东海岸，而南非海马主要分布于南非，具有独特的头
冠、较小的体型。因此，这些海马均被认为是独立的物种[2，10]。
2.5基因条码鉴别高冠海马复合体
冠海马又称高冠海马，是指头冠特别高大、形态十分相似的几种海马，因较难鉴别而曾经被称为高冠海马复合体。对韩国和日本采集的182个高冠海马复合体标本进行形态学和基因分析，根据头冠的形状、躯干骨环、尾骨环的数量以及背鳍底部是否有翼尖棘等特征，可分为高冠海马、花海马（Hippocampus sindonis）和新种韩国海马（Hippocampus haema）[11]。高冠海马的头冠特别高大，头冠顶端有4个小突起和1个翼尖棘；花海马头冠高度中等，头冠顶端有5个小突起，无翼尖棘；韩国海马头冠高度中等，头冠顶端有4个小突起和2个翼尖棘。韩国海马仅见于朝鲜海峡、九州岛西部，与其他高冠海马不能杂交。基于线粒体Cytb、16S rRNA和12S rRNA的差异也支持对图1基于COI 基因的管海马复合体系统发育树
0.002
Hippocampus kuda（NC010272）
Hippocampus algiricus（NC065491）
Hippocampus capensis（NC042791）
Hippocampus fuscus（MG875012）
Hippocampus reidi（NC027931）
0.002
0.005
0.004
0.007
0.012
0.008
0.01
95
94
0.001
179
这3个物种的识别。
一些鱼类学家试图根据颜和皮肤细丝来区分
高冠海马和花海马，但有研究发现，皮肤细丝生长不
规则，无法区分欧洲海马（Hippocampus hippocampus）
和长吻海马（Hippocampus guttulatus）[12]。
3结论与讨论
一些海马具有独特的形态特征，可以依据形态进
行分类。但体、斑纹等形态不仅因年龄、性别而有
所不同，而且很容易受到环境的影响，同一种海马在
不同海域生活可能在形态上表现出差异，可能被命名
为不同的物种。全球已知的海马可以确认的有效物
种可能只有41种。此前的报告有一些为同物异名，如
双斑海马（Hippocampus biocellatus）是假眼海马（Hippo-campus planifrons）的同物异名[2]。欧洲和北非仅有的两种本土海马长吻海马和欧洲海马体表的棘以及棘
的大小和数量等形态特征高度可变，以此鉴别物种都
是不可靠的[13]。形态相似的物种也可能是不同的物种。刺海马（Hippocampus histrix）COI序列差异大于6%[14]，因刺海马地理分布很广，从南非到夏威夷都有记录，在非洲之角和印度之间有很大的断裂带，因而
可能隐藏潜在的物种。
COI基因条码可以鉴别大部分海马。我国主要药材市场的海马应用COI基因进行检测，发现共有23个物种[15]。一些海马用单一DNA条形码无法进行准确鉴定，需要研究进化更快的基因条形码。对三斑海马的COI、16S rRNA和ATP6进行研究，表明这些条形码均可以鉴定三斑海马及其他混伪品海马药材[16]。
对少数亲缘关系十分接近的海马物种，需要测定线粒体全序列进行比较和鉴定。贾氏海马（Hippocampus jayakari）的线粒体全基因组长度为16520bp，系统发育分析表明，贾氏海马与其他13种海马物种表现出相对较远的亲缘关系[17]。
目前，基因库和BOLD数据库还缺乏很多种海马
的基因条码信息。部分海马的基因条码信息数量太
少，还有部分信息未经认证，可能存在错误。因此，不
能仅仅依靠现有的基因条码信息进行准确的鉴定。
此外，研究表明，物种鉴定需要分类学家、生态学家、
分子生物学家和地球科学家等科学团队密切合作，才
能从空间、时间和形式等方面解决物种演化的复杂
性。因此，基因技术还应该与传统的形态学分类方法
相结合，才能不断提高DNA条形码技术的准确性。参考文献
[1]BAINE M S P，BARROWS A P W， al.Resi-dence and movement of pygmy seahorses，Hippocampus bar-gibanti，on sea fans（Muricella spp.）[J].Coral Reefs，2008（27）：421.
[2]LOURIE S A，POLLOM R A，FOSTER S J.A global revision of the Seahorses Hippocampus Rafinesque1810（Actinop-terygii：Syngnathiformes）：taxonomy and biogeography with recommendations for further research[J].Zootaxa，2016，4146（1）：1-66.
[3]HOU F，WEN L，PENG C，et al.Identification of marine tradi-tional Chinese medicine dried seahorses in the traditional Chinese medicine market using DNA barcoding[J].Mitochon-drial DNA A，2016，29（1）：107-112.
[4]GRAHAM S，RICHARD S，HIROYUKI M，et al.Hippocam-
pus japapigu，a new species of pygmy seahorse from Japan，with a redescription of H.pontohi（Teleostei，Syngnathidae）[J]. Zookeys，2018，779（779）：27-49.
[5]HEARD J，CHEN J，WEN C.Citizen science yields first records of Hippocampus japapigu and Hippocampus denise （Syngnathidae）from Taiwan：a hotspot for pygmy seahorse diversity[J].Zookeys，2019，883：83-90.
[6]SHORT G，CLAASSENS L，SMITH R，et al.Hippocampus
nalu，a new species of pygmy seahorse from South Africa，and the first record of a pygmy seahorse from the Indian Ocean（Teleostei，Syngnathidae）[J].Zookeys，2020，934：141-156.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版：一部[M].
北京：中国医药科技出版社，2015.
[8]蒋超，刘富艳，金艳，等.基于形态和DNA序列分析的海马
类药材商品基原调查[J].中国中药杂志，2018，43（23）：4553-4561.
[9]JAHARI P N，MALIK N F，SHAMSIR M S，et al.The first complete mitochondrial genome data of Hippocampus kuda originating from Malaysia[J].Data Brief，2020，31：105721.
[10]SILVEIRA R B.，SICCHA-RAMIREZ R，SILVA J R S，et al.Morphological and molecular evidence for the occur-rence of three Hippocampus species（Teleostei：Syngnathi-dae）in Brazil[J].Zootaxa，2014（4）：317-332. [11]HAN SY，KIM J K，KAI Y，et al.Seahorses of the Hippocam-
pus coronatus complex：taxonomic revision，and descrip-tion of Hippocampus haema，a new species from Korea and Japan（Teleostei，Syngnathidae）[J].Zookeys，2017（712）：113-139.
[12]CURTIS J M，Vincent A C.Life history of an unusual ma-
（下转第184页）
180