基于ITS及 atpBrbcL 等多片段鉴定粗壮秦艽及其近缘种
作者：熊波  赵志礼  倪梁红 嘎务  米玛
来源：《中国中药杂志》2015年第23期
        [摘要] 传统藏药“解吉”主要基原植物之一粗壮秦艽Gentiana robusta分布区广，且与近缘种呈同域分布现象，遗传背景复杂。多居平行取样，直接测定该物种及其近缘物种麻花艽G. straminea、粗茎秦艽G. crassicaulis、长梗秦艽G. waltonii，外类椭圆叶花锚Halenia elliptica的rDNA ITS区序列及叶绿体DNA的matK，rbcL，rpoC1，trnL （UAA），psbAtrnH，atpBrbcL，trnS（GCU）trnG（UCC），rpl20rps12，trnL（UAA）trnF（GAA）序列228条；TA克隆法测定粗壮秦艽ITS区序列120条。对粗壮秦艽进行基因分型，形态学及DNA分子证据显示其可能为一杂交物种；克隆序列中寻稳定位点，多片段组合可鉴定粗壮秦艽及其近缘种。该文对遗传背景多样的药用植物鉴定研究具有重要参考价值。
        [关键词] 粗壮秦艽；ITS序列；自然杂交；遗传多样性；叶绿体DNA；分子鉴定
        我国青藏高原是世界龙胆科龙胆属Gentiana L.秦艽组Sect. Cruciata Gaudin植物分布中心，国产16种[1]。该组植物具有重要的药用价值，除国家药典收载的中药秦艽4种基原植物外，
本组其他物种常作为民族药物的来源，如藏医药中“赤巴病”的藏药“解吉”来源于秦艽组多种植物[2]。
        该组植物均具莲座叶丛，植株基部被枯存的纤维状叶鞘等特征，共性明显，一些近缘种的鉴定较难把握，如粗茎秦艽与西藏秦艽之间种的形态鉴定问题[3]；一些物种可能存在同种不同个体的染体倍性不同[4]；加之同域分布的不同物种还可能存在自然杂交情况[5]等特性，当务之急是开展深入的遗传多样性分析及品种鉴定工作。
        近年来，作者开展了秦艽组及藏药“解吉”的品种整理工作[68]。在实地考察中注意到，作为传统藏药“解吉”主要基原植物之一的粗壮秦艽G. robusta King ex Hook. f.，分布区广，且与近缘种呈同域分布现象，种内个体形态特征变化幅度较大。花序中小花排列情况、有无小花梗是秦艽组种间分类的主要依据，典型的粗壮秦艽植株其花序小花无花梗，排列紧密呈头状[1]；但一些居出现“小花具花梗，排列较为疏松”的形态过渡性特征而与近缘种麻花艽G. straminea Maxim.植株相似。初步遗传背景与形态特征分析，显示粗壮秦艽可能为一自然杂交物种。
        近年来，DNA分子鉴定技术已经被广泛应用于中药材的鉴定当中[910]。为此，作者在
野外考察、分类学鉴定基础上，采集西藏产粗壮秦艽以及近缘物种麻花艽G. straminea Maxim.、长梗秦艽G. waltonii Burk.和粗茎秦艽G. crassicaulis Duthie ex Burk.居样本，以龙胆科花锚属植物椭圆叶花锚Halenia elliptica D. Don为外类，分别测定核糖体nrDNA ITS 区及叶绿体DNA的matK，rbcL，rpoC1，trnL （UAA），psbAtrnH，atpBrbcL，trnS（GCU）trnG（UCC），rpl20rps12，trnL（UAA）trnF（GAA）序列并进行多片段系统分析，以期为建立遗传背景复杂多样的粗壮秦艽及其近缘物种的分子鉴别方法提供基础资料。
        1材料与方法
        1.1样品与凭证标本
        实验材料均为自采，多居平行取样，新鲜叶片经硅胶快速干燥，备用；凭证标本经上海中医药大学赵志礼教授鉴定，存放于上海中医药大学中药学院药用植物标本室，见表1。
        1.2总DNA提取
        取硅胶快速干燥的叶片，液氮中研磨成粉末，改良CTAB法[11]进行总DNA提取。
        1.3PCR扩增和测序
        对nrDNA ITS区及叶绿体DNA的matK，rbcL，rpoC1，trnL （UAA），psbAtrnH，atpBrbcL，trnS（GCU）trnG（UCC），rpl20rps12，trnL（UAA）trnF（GAA）共10个片段进行PCR扩增，各片段引物见表2。
        所有扩增产物经电泳确认后送上海生工生物有限公司纯化并测序（Axygen胶回收试剂盒纯化，ABI 3730xl型测序仪测序）。直接获得12条ITS区完整序列及216条叶绿体DNA片段序列（除去粗壮秦艽各居ITS区序列图谱杂合程度高，无法判读外）。
        1.4nrDNA ITS区克隆序列的获得
        将粗壮秦艽各居样品的ITS区扩增产物送上海生工生物有限公司进行克隆测序。每个样品各挑取10个阳性克隆进行测序，共获得120条克隆序列。
        1.5序列数据分析
        各片段起止范围参考GenBank中龙胆属相关片段。全部序列上传至Genbank，共获得348个登录号，见表3。序列数据用MEGA 5.0软件进行分析，见图1。
        1.6自然杂交物种粗壮秦艽的分子证据
        1.6.1ITS序列构建系统发育树 基于ITS区序列，以椭圆叶花锚为外类，构建UPGMA系统树（Kimura 2parameter 模型，bootstrap 1 000次重复）。结果显示，外类椭圆叶花锚单独成一支首先被区分开；粗茎秦艽与长梗秦艽各聚为一支；而麻花艽与粗壮秦艽120条克隆序列中的113条共聚为一支，显示了高度的同源性。另外7条克隆序列遗传距离较大（占5.8%），见图2。
        1.6.2叶绿体DNA序列构建系统发育树 基于各样品的9个叶绿体DNA片段组合，以椭圆叶花锚为
        外类，构建UPGMA系统树（Kimura 2parameter 模型，bootstrap 1 000次重复）。结果显示，椭圆叶花锚首先被区分开；麻花艽与粗壮秦艽各聚为一小支，再共具为一大支，支持率100%。粗茎秦艽与长梗秦艽各聚为一小支，支持率100%。由于质体DNA具有单亲遗传性质[5]，该系统发育树支持麻花艽可能为粗壮秦艽的母系亲本，见图3，此推论亦得到上述ITS区序列系统发育树的佐证。
        1.7粗壮秦艽与近缘物种的鉴定
        基于ITS区克隆序列，单倍型及位点信息分析比较，确定粗壮秦艽所有克隆序列中相一致，并可与粗茎秦艽区分的稳定鉴别位点3个；与长梗秦艽区分的稳定鉴别位点2个；但与麻花艽比较，尚未发现稳定鉴别位点，见表4。
        筛选出7bootstrap 5个叶绿体DNA片段（各物种的rpoC1和trnL序列分别完全一致，无变异位点）。基于matK片段可鉴别麻花艽和粗茎秦艽；rbcL片段可鉴别粗茎秦艽；psbAtrnH片段可鉴别长梗秦艽；trnStrnG和rpl20rps12片段分别都可将粗壮秦艽和粗茎秦艽鉴别。综上，结合多个叶绿体片段（matK，psbAtrnH，trnStrnG）可将粗壮秦艽与其3个近缘物种有效区分。ITS区序列无法鉴别粗壮秦艽及其亲本种麻花艽，但在叶绿体DNA中发现matK，trnStrnG，rpl20rps12片段各有1个稳定的特异性鉴别位点，见表5。
        2讨论
        根据形态学及核基因ITS区高度杂合等特性，可初步推断粗壮秦艽为一自然杂交种。在所测定的9个叶绿体DNA片段共4 659碱基中，粗壮秦艽与麻花艽G. straminea仅有3个位点差异（表5），两者序列保持高度一致；基于叶绿体DNA的系统发育树中，粗壮秦艽与麻花艽共聚为一支，支持率为100%。ITS区序列比较结果显示，粗壮秦艽克隆序列中检测到麻花
艽的特异性分子标记。基于ITS区序列系统发育树中，粗壮秦艽120条克隆序列中的113条与麻花艽共聚为一大支，显示了高度的同源性。同时，野外考察注意到一些粗壮秦艽个体的花序特征，均出现形态过渡而与近缘种麻花艽植株相似；由此推断麻花艽可能为粗壮秦艽的母系来源。
        ITS区序列系统发育树中，另外7条克隆序列（占5.8%）与粗壮秦艽绝大部分序列及秦艽组其他3种植物均显示较大遗传距离（图2），推测其可能为物种间的遗传渗入导致nrDNA产生的多样