Vol. 36，No. 4
Apr- 2021
2021年4月第36卷第4期
中国粮油学报
Journal  of  the  Chinese  Cereals  and  Oils  Association 黑龙江省种植大豆品种遗传多样性 分析及与性状关联SSR 标记筛选
李志江2，牛江帅4李忍1姜鹏1鹿保鑫1张东杰1阮长青V
(黑龙江八一农垦大学食品学院S 大庆163319)
(北大荒现代农业产业技术省级培育协同创新中心2，大庆163319)
(黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心3，大庆163319)
(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院4，大庆163319)
摘要为从分子水平鉴定黑龙江省种植大豆7种的遗传多样性，并筛选与蛋白质、脂肪、百粒重和水分
等大豆主要性状显著关联的SSR 分子标记，利用18对SSR 引物，采用荧光毛细管电泳法分析黑龙江省75个
种植大豆7种遗传多样性，并与性状进行关联分析
。结果表明：18个SSR 标记中的10个标记可以实现单对引
物准确鉴别42个大豆7种，18个SSR 标记的等位变异的数目变化为3 (Satt387) -12个(Satt100)，平均每个 位点等位变异数为7- 333个，多态信息指数范围为0-146( Sat_084) -0- 675 ( Satt442)，平均多态信息指数为
0- 405 ；体结构分析发现，该体分为3个亚；性状关联分析表明，标记Satt175和Satt100与脂肪存在显著
关联，标记Satt514和Satt294与百粒重存在显著关联，其中Satt294与百粒重和水分均存在显著关联。
研究结 果为探索大豆7种间的亲缘关系，挖掘大豆相关性状的关联位点，验证大豆种质资源的真实性，以及保障黑龙
江省大豆7牌和食7安全提供参考。
关键词 大豆 SSR 标记 毛细管电泳 遗传多样性 关联分析
中图分类号:S565- 1 文献标识码:A  文章编号/
003 -0174(2021)04 -0037 -08
网络首发时间：2020 -12 -15 11 ：29 ：35
网络首发地址：https ：//kns. cnki. net/kcms/detail/11.2864. TS. 20201214. 1242. 018. html
黑龙江省是我国重要的大豆产区，脂肪和蛋白
质等专用型大豆品种较多，但存在品种繁多乱杂、
越区种植和混合种植等现象，严重影响了黑龙江省 大豆的产量和质量，导致品牌保护难、种植和食用 安全性低等问题⑴。传统的大豆品种鉴定，主要采 用田间种植鉴定方法，但该方法时间长、效率低、工
作量大、结果准确性低，所需鉴定目标性状大都为
数量性状，受环境和品种同质化影响较大，给大豆 品种的准确鉴定带来一定困难［2,3］。在分子鉴定水
平上,DNA 指纹图谱技术则具有高效准确、不受环
境条件影响和实验操作简单等优点，已广泛应用于 植物品种真实性鉴定及纯度检测研究⑵。目前，广 泛应用的DNA 分子标记主要包括限制性片段长度
基金项目：黑龙江农垦总局指导项目(
HKKYZD190803)
，黑龙江
省科技厅重大项目(GA18B102
)收稿日期：2020 -06 -17
作者简介：李志江，男,1977年出生，教授，
博士，
食品科学与工程 通信作者：阮长青，男,1966年出生，教授，博士，食品质量与安全
多态性(RFLP )、随机扩增多态性DNA  (RAPD )、扩 增酶切片段长度多态性(AFLP )、简单序列重复长
度多态性(SSR )和单核昔酸多态性(SNP )等。其
中,SSR 分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共 显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短和技术成
熟等特点，已广泛应用于植物品种鉴定及纯度检测 的研究⑷。
目前，国内已有学者采用SSR 标记技术鉴定大 豆品种并构建指纹图谱，如徐海风等⑸利用6对SSR
引物对淮河以南地区26份菜用大豆品种(系)构建
指纹图谱，将26份菜用大豆品种(系)逐一区分。高 运来等［6］利用9对SSR 引物，完全区分黑龙江省83
份参试大豆品种并构建了一套大豆品种的分子ID o
何琳等［7］利用6对SSR 引物鉴定了长江流域区域的
42 大 品 , 的分 ID 。
据均为满足大豆品种真实性鉴定的需求奠定了基
础，但采用SSR 标记并结合大豆体关联分析鲜有 报道。本研究的目的是采用分子标记技术，对黑龙
38中国粮油学报2021年第4期
江省75个大豆品种进行遗传多样性分析，并筛选与性状关联的SSR标记，为大豆种质资源真实性鉴定提供基础数据，为保障黑龙江省优质大豆种植和食用安全提供参考。
1材料与方法
1.1供试大豆
选用黑龙江省10个农场和地区的75份品种为参试材料，具体信息见表1。1.2大豆DNA提取
取发苗至三叶一心期大豆叶片于2mL离心管内, -20C过夜，加1mL DNA提取液研磨成匀浆后,60C 水浴1h，于12000r/min条件下离心5min，取上清液备用。在上清液中加入等体积的氯仿，剧烈振荡，再次离心取上清液。重复1次后，加入等体积的异丙醇，-20 C放置1h，于12000r/min条件下离心5min，弃上清液后加入500咽70%乙醇洗2次，风干。加入100咽TE 缓冲液溶解，用于毛细管电泳检测。
表1黑龙江省10个农场和地区的75份品种试样信息
原始编号品样采集地区原始编号品样采集
1-7黑河43Heihe43建设农场14-23076Longken3076五大池农场14-43318Longken3318五大连池农场14-33307Longken3307五大池农场15-517kenfeng17云山农场14-53319Longken3319五大池农场17-1大地5Dadi5五大连池农场14-63320Longken3320五大池农场17-3大地8Dadi8五大连池农场14-73402Longken3402五大池农场17-4大9Dadi9五大连池农场14-83416Longken3416五大池农场17-6大12Dadi12五大连池农场15-116Kenfeng16855农场2贺豆1Hedou1北安市15-220Kenfeng20856农场3东农豆119Dongnongdou119襄河农场15-314Kenfeng14云山农场5克山1号Keshan1#中储粮15-437Kenffeng37云山农场7华疆4Huajiang4爱辉区17-5大11Dadi11五大池农场12金源55Jinyuan55爱辉区18金1Jinfeng1五大池农场16圣豆43Shengdou43北安市22901Beiyi901五大池农场19金4Jinshan4五大连池农场23东庆9号Dongqing9#襄河农场20建农19Jiannong19五大连池农场24东7Dongsheng7安市2192Kendou92五大连池农场26研1Fengyan1#襄河农场253Longda3北安市27富强5号Fuqiang5#襄河农场
355Longbei5五大连池农场28广民5号Guangmin5#襄河农场383Nenya3#中储粮2918Jiadou18襄河农场40新品种1号Xinpinzhong1#中储粮31130Longda130襄河农场411152Youjidou1152中储粮32173Mengdou173襄河农场4215Mengdou15中储粮33鑫农13号Xinnong13#襄河农场4593029302五大连池农场34登科8Dengke8安市46466建设农场36华2Hualaidou2五大池农场47多收31A1Duoshou31A1云山农场37南繁6号Nanfan6#中储粮52东61Dongyi61襄河农场39品1092Pinzhong1092中储粮56九研13号Jiuyan13#襄河农场43江农416Jiangnong416爱辉
58-2农2Nongnong2#襄河农场4460886088五大池农场76农23Kennong23854农场50109Beiya109襄河农场79垦农30Kennong30855农场51北兴4号Beixing4#襄河农场92黑河53Heihe53五大连池农场54贺丰6号Hefeng6#襄河农场1-1黑河43(1152)Heihe43(1152)中储粮5515Hengdou15#襄河农场4合农95Henong95爱辉区578Kuodou8#襄河农场826Beidou26爱辉区58-11Laidou1#襄河农场9中黄901Zhonghuang901爱辉区77垦农36Kennong36云山农场1114Haojiang14中储粮78垦农37Kennong37云山农场13农91Kennong91五大连池农场82东10Dongsheng10云山农场14-13075Longken3075五大连池农场82东10Dongsheng10云山农场
第36卷第4期李志江等黑龙江省种植大豆品种遗传多样性分析及与性状关联SSR标记筛选39
表2SSR引物信息表
引物名称染体编号物1
Satt514Gm17GCGCCAACAAATCAAGTCAAGTAGAAAT Satt233Gm08AAGCATACTCGTCGTAAC
Satt138Gm18GACATTTTTCCACGGATATTGAAT Satt216GM02TACCCTTAATCACCGGACAA
Satt175GM07GACCTCGCTCTCTGTTTCTCAT
Satt100GM06ACCTCATTTTGGCATAAA
Satt551GM07GAATATCACGCGAGAATTTTAC
Sat_084GM03AAAAAAGTATCCATGAAACAA
satt156GM19CGCACCCCTCATCCTATGTA
satt239GM20GCGCCAAAAAATGAATCACAAT
Sat_128GM10CCTTCTCCCTCTCATAC
Satt380GM16GCGAGTAACGGTCTTCTAACAAGGAAAG Satt442GM12CCTGGACTTGTTTGCTCATCAA
Satt369GM15AACATCCAAAGAAATGTGTTCACAA sat_222GM17GCGGTCATGTGTCCCATTTAATTTAATCAA satt295GM03GCGGGCCATATATTTTATTTGTAGGTTCA Satt387GM03GCGTTACGTTTCACTATTTATTTAACAT satt294GM04GCGGGTCAAATGCAAATTATTTTT
引物2 GCGGTCATCTAATTAATCCCTTTTTGAA GCGGTGCAAAGATATTAGAAA
AACGGGCGATTTATGGCTAT
AGGGAACTAACACATTTAATCATCA GGTGACCACCCCTATTCCTTA
TTGGAAAACAAGTAATAATAACA
TATATGCGAACCCTCTTACAAT
TTGGGACCTTAGAAGCTA
CCAACTAATCCCAGGGACTTACTT
GCGAACACAATCAACATCCTTGAAC
CAAGTTTTATACCATTCATC
GCGTGCCCTTACTCTCAAAAAAAAA
GCGGTTCAAGGCTTCAAGTAGTCAC
GCGAGTTCGAATTTCTTTTCAAGT GCGATGTGCCTCAAAAACTAACATCAATAA GCGCCAGGTCTAGTTTCTATTGATTTGG
GCGGCAGGCTAGCTACATCAAGAG
GCGCTCAGTGTGAAAGTTGTTTCTAT
1.3PCR扩增及毛细管电泳检测
从已发表文献中选出多态指数高的SSR标记引 物，分布在15条染体上的18对引物(如表2)018对SSR标记引物序列来源于Soybase(soy­/dlpages/)，由检测公司完成PCR扩增及毛细管电泳检测。正式实验前，随机选取6个样本对引物进行预实验，通过琼脂糖电泳确定是否有目的扩增产物，从而确定引物是否可用。
1.4数据处理
1.4.1SSR毛细管电泳有效特异峰的判定方法
扩增中容易出现影子峰干扰的问题，而影子峰是由Taq酶和SSR的特性决定的，基本上难以克服0杂合基因型的二倍体在理想情况下应该是扩增出2条等高的峰，但由于受扩增条件、加样的随机误差、DNA模板质量及DNA浓度等因素的影响，致使扩增出的等高。对型的倍体特异
的判断，采用小峰面积如果不及大峰面积的60%则判定为杂带的标准，对于通过优化扩增条件的方法难以改善，以及无法判读的位点进行舍弃。
1.4.2标记基因型的数据分析
基因多态性通过PowerMarker V3.0得到每个SSR分子标记的多样性信息［8］，如多态性百分比、最小等位基因频率/位点、等位基因数/位点、有效等位基因数/位点、等位基因型数/位点、基因多样性/位点、多态性信息含量/位点和多样性指数/位点等，基于位点多样性信息的平均水平来评估体遗传多样性。
1.4.3体关联数据分析
用Structure V2.3.4件体分析⑼。参数设置为:K值选取1~10，重复次数为5；将MCMC(Markov chain monte carlo)开始时的不作数迭代设为100000次，再将不作数迭代后的MC­MC设为1000000次，其余参数采用软件默认的设置。根据lnP(D)计算AK，依据AK值选择一个合适的K值，并得到该K值对应的Q矩阵。将Clump 软件分析的结果传递给Distruct软件生成Q值条形堆积图。然后利用Tassel V2.1软件［0］将基因型数据生成亲缘关系矩阵(K矩阵)，结合等位变异数据、基因型数据、各个环境的表型值、Q矩阵，利用混合线性模型MLM(Mixed linear model)进行性状和标记之间的关联分析，并计算标记位点在P<0.05和P<0.01时对表型变异的贡献率()。在已获得关联位点的基础上，再进行优异等位变异的发掘，通对SSR位点等位异型应计，最
表型性状显著关联的位点。最后通过PowerMarker V3.0计算基于等位基因频率的遗传距离，采用邻位相连(Neighbor-Joining,NJ)法进行聚类分析，并输出聚类树［ii］0
2结果与分析
由于SSR扩增中容易出现影子峰干扰以及非特异峰的问题，需要对有效特异峰进行判定。以Satt233标记的结果为例，在图1a中，箭头所指的峰为有效特异峰；图1b中，箭头所指的2个峰面积接近，且小峰面积超过大峰面积的60%，视为有效特异。
40中国粮油学报2021年第4期
表342大品身证
Satt100Sat128
编号品编码编号品编码
3东农豆1190001001027富强5号000000101
19金40011000032173000001010
3830010000033农13号000000001
4593020100000037南繁6号010000001
47多收31A10001100039品1092000010001
2290111000000446088100100000
28广民5号0010001077垦农36001000001
Satt233Satt442
编号品编码编号品编码
17-6大地12000110015-5171000000
5克山1号001100052东610100100
459302010000014-333070001010
18金1100000026研10001100
26丰研1号100001133农13号0010010
Satt369Satt295
编号品编码编号品编码
12金5500000012192000001
4农95010010023东庆9送010100
2918100000033鑫农13号010000
Satt156Satt239
编号品编码编号品编码
22901011002贺豆101000
28民5110002290100100
77农36000113113010010
Satt138Satt175
编号品编码编号品编码
79农300000110111401001
15-314000000128民501100
Satt514Satt216
编号品编码编号品编码
4460880100158-1100001
扩增片段/bp
b
图1SSR扩增片段有效特异峰型的判定
2-2大豆品种指纹编码的构建
毛泳检测结果，对每个SSR分：记有效谱带的“有”或“无”采用“”或“0”进行系统，构建大豆品种的。构建了10个单一SSR分42大品种的身份证(表3)，其中Satt100和Sat_128的力最强，分别能
出7个品。个别品被多
出来，如901和6088。33大豆品 多个SSR共同区分。
2-3性分析
采用18SSR分对75大豆品种进行多样性分析，各位点等位变异的数目从3(Satt387)
-
第36卷第4期李志江等黑龙江省种植大豆品种遗传多样性分析及与性状关联SSR标记筛选41
表4大遗传多样性分析统计
引物标记基因频率等位基
型
样大
等位基
因数
等位基
型
性
基
多样性
杂合度
多态性
含量（PIC）
Satt5140.5347757350.9730.5920.0680.520 Satt2330.727107575610.4370.2800.399 Satt1380.8116757470.9870.3290.0140.311 Satt2160.52067575510.5750.1330.490 Satt1750.7368757050.9330.4300.1290.399 Satt1000.433127575810.6580.7200.597 Satt5510.62767575410.5240.1330.457 Sat_0840.91337575210.1580.0930.146 Satt1560.74787575510.4120.1070.378 Satt2390.92077575510.1520.1070.148 Sat_1280.867107575910.2420.1330.232 Satt3800.64747575310.4890.1470.411 Satt4420.320107575710.7260.1070.675 Satt3690.540107575710.6210.1200.567 Sat_2220.43387575410.6690.2000.606 Satt2950.58797575610.6010.1330.562 Satt3870.86737575210.2310.0270.204 Satt2940.88757575310.2070.1200.196值0.6737.3337574.556  5.1670.9940.4470.1540.405
表5相关性状与标记关联情况
物性
df
Marker
F Marker P Marker
#perm
Marker
p-perm
Marker
p-adj
Marker
df Model
df
Error
MS Error Rsq Model Rsq Marker
Satt175脂肪8.000  5.1930.0001000.0000.0210.00111.00057.000  5.100  1.0000.000 Satt100脂肪12.000  6.9770.0001000.0000.0040.00115.00058.000  4.311  1.0000.000 Satt514重  6.000  4.8570.0001000.0000.0060.0019.00060.000  1.9550.3440.319 Satt294重  5.000  6.8710.0001000.0000.0120.0018.00065.000  1.8770.7300.143 Satt294水分  5.000  6.7340.0001000.0000.0090.0018.00065.0000.6260.5880.214 :F Marker和P Marker F-检验的F-统计量和P-值；#perm Marker运的排;P-perm Marker对单的测试；-adj
marker是针对多个测试调整的标记P值;MS Error为模型的误差均方；Rsq Model为模型的R2;Rsq Marker为标记的R2;df Marker A df Model与df Error为各自的自由度。P-adj marker值等于或小于0.05的标记视为有效［2］。
12个（Satt100/，平均每个位点等位变异数为7.333
个。各位点多态量（PIC）从0.146（Sat_084/-
0.675（Satt442/，平均多态含量为0.405（表4）
中,PIC可以用量基异程度的高低，一般认
，当PIC<0.25，为低度多态性物，当0.25<
PIC<0.50时，为中度多态性物,PIC>0.50时为
高度多态性信息引物。因此,Satt514、Satt100、Satt442、
Satt369、Sat_222和Satt295高度多态性物。
2.4构分析
通过Structure软件对75份大豆品种的种结构分析结果显B，最显著的AK出现在K从2-3，峰值出现在K为3（图2a）o确定的K 值和Clump的Q矩阵，经Cluster件分类后生Q值条积图。不同的域表示不同的“血统”，或意味着该大同的祖先体。结果显示，本研究的大体大体以分为3个，部，品着基因频率的差异（图2b）o 1.00-
0.00
b体结构（K=3）
图2
大豆体遗传结构分析