•临床诊疗•
ABCBA基因G2677T.C3435T多态性与阿托伐他汀
降脂疗效的关系
堵正洁1沈珍贤$
1无锡市惠山区人民医院（无锡214151）2南京医科大学附属无锡精神卫生中心（无锡214151）
【摘要】目的分析4BCB1基因G2677T,C3435T位点在我国汉族血脂异常人的分布特征；探讨ABCB1基因G2677T和C3435T多态性与阿托伐他汀降脂疗效之间的关系。方法依据中国成人血脂异常防治指南
判断标准，在中国汉族人中收集205例受试者，抽取其外周血液样本，利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多
态分析（PCR-RFLP）技术对受试者4BCB1进行基因分型，同时在阿托伐他汀3个月前后检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）血脂水平，将205例患
者后4项指标恢复正常分为A组，后4项指标仍有一项及一项以上异常分为B组，来分析G2677T和
C3435T基因多态性与阿托伐他汀降脂疗效的关系，以及G2677T和C3435T等位基因的分布特征。结果205例患
者中G2677T位点GG型、GT型、TT型基因频率分别为19.51%、42.44%、3&05%；C3435T位点CC型、CT型、
TT型基因频率分别为34.63%、49.76%、15.61%。G2677T位点A组与B组等位基因突变率为5&46%与
60.67%,A组GG型、GT型、TT型基因频率分别为23.08%、36.92%、40.00%,B组GG型、GT型、TT型基
因频率分别为13.33%、52.00%、34.67%；C3435T位点A组与B组等位基因突变率为40.77%和40.00%,A组
CC型、CT型、TT型基因频率分别为34.62%、49.23%、16.15%,B组CC型、CT型、IT型基因频率分别为
34.67%、50.67%、14.66%；ABCB1基因G2677T、C3435T位点基因型在A组和B组中分布相同，无差异（P>
0.05）o205例患者中，用药前ABCB1基因G2677T位点IT型血浆TC、LDL-C水平高于GT型（P<0.05）。用药
后ABCB1基因G2677T位点GT型血浆TC、HDL-C、LDL-C水平低于GG型与TT型（P<0.05）；用药后4BCB1基
因C3435T位点IT型血浆TC水平低于CC与CT型（P<0.05），而CC型血浆LDL-C水平高于IT型（P<0.05）。
结论4BCB1基因G2677T、C3435T位点多态性与血浆血脂水平有关，但ABCB1基因G2677T、C3435T位点多态
性可能与阿托伐他汀3个月降脂疗效无关。
【关键词】阿托伐他汀；ABCB1；基因多态性；降脂疗效
DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2019.02.016
近年来，随着人们生活水平的提高，我国心血管疾病患病率及死亡率处于上升趋势⑷。研究表明，心血管疾病的发生发展与血脂异常密切相关⑵。血脂异常是脂质代谢紊乱、转运异常的表现，包括血清总胆
固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高，以及血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低⑶。阿托伐他汀属于瓮甲基戊二酸辅酶A还原酶抑制剂，目前在临床上广泛用于降脂和稳定动脉硬化斑块⑷。阿托伐他汀在体内主要通过抑制3-包基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶来抑制胆固醇的合成，从而使血浆TC、TG、LDL-C水平降低，同时使HDL-C水平轻度升高。然而，不同患者之间阿托伐他汀调脂疗效差异较大⑸，有研究表明，阿托伐他汀是ATP结合盒亚家族B（MDR/TAP）成员1转运蛋白（ATP-binding cassette,sub-family B（MDR/TAP）,member1,ABCB1）的基因表达产物P■糖蛋白（P・glycoprotein,P-gp）的特异性的转运底物同。在已发现的的近50个单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）中，外显子26的C3435T和外显子21的G2677T/A均能够影响P-gp的转运底物，很可能致阿托伐他汀疗效的个体化差异出现切。目前国内对于基因SNPs与血脂异常及调脂疗效相关性研究比较少，故本研究率先从临床的角度出发，初步探讨了ABCB1基因G2677T、C3435T多态性与阿托伐他汀降脂疗效的关系，为今后临床的个体化降脂方案的制订提供了依据。
1资料与方法
1.1研究对象
2014年1月—2016年1月收集无锡市精神卫
生中心血脂异常住院患者，受试者纳入标准：符合2007年中国成人血脂异常防治指南⑷，患者血脂水平至少符合一项以下血脂参照标准，TCM 5.18mmol/L,TGml・70mmol/L,LDL-C  3.37 mmol/L,HDL・C W1.04mmol/L；①研究前2周未服用过各类降脂相关药物；②研究前2周未服用过影响血脂水平及影响阿托伐他汀代谢的药物。
排除标准：①有继发性血脂异常、活动性肝病、严重肾功能不全、对阿托伐他汀中任何成分过敏、严重创伤或重大手术者；②孕妇或可能受孕的育龄女性；③哺乳期妇女；④吸烟饮酒患者。
共收集205例汉族患者，其中男127例，女78例，年龄24~94岁，平均（65.65±13.65）岁，病程3~24个月，平均（13.10±6.02）个月。
1.2试剂与仪器
氯仿、异丙醇、乙醇等为国产分析纯试剂，使用时按需要配制。Reveres Transcription PCR相关试剂：焦炭酸二乙酯（DEPC）、Trizol RNA提取液、逆转录试剂盒，Taq聚合酶、100bp DNA Lad­der，琼脂糖均购自大连宝生生物工程有限公司。PCR引物设计，该实验采用的引物均为GenBank 获取cDNA全序列后，均由上海Invitrogen公司合成。
垂直电泳槽与Gel DOC2000凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司），PCR扩增仪（德国Eppen-dorf公司），
全自动紫外分光光度计Du640（美国Beekman公司），高速冷冻离心机（德国Heraeus 公司），罗氏全自动血生化分析仪Modlar P800（德国罗氏公司）。
1.3方法与分组
患者均单一服用阿托伐他汀钙胶囊（国药准字H20051984,10mg/片，天方药业有限公司）20mg每天，连续服用3个月。服药期间的3个月除阿托伐他汀外均未服用过其他影响血脂水平及其代谢的药物，无冠心病、高血压病史、糖尿病，心电图检查均正常。3个月后均进行4项血脂指标检测。将205例患者3个月后4项指标TC、TG、LDL-C、HDL-C恢复正常分为A组，后4项指标仍有一项及一项以上异常分为B组。
1.4基因分型
抽取外周静脉血2mL，置于乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝管中，-80T保存。采用酚-氯仿法200jjl L抽提DNA，紫外分光光度法测定各样本DNA浓度。采用聚合酶链式反应一限制性片段长度多态分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）方法分析患者的基因分型。PCR引物序列为，ABCB1 G2677T正向弓|物：5'-AGTHTCAGAAAATAGAAG CATGAGT-3，；反向弓［物：5—GGGAGTAACAAAA TAACACTGATTAGA-3，。ABCB1C3435T正向引物: 5，-TGTGCTGGTCCTGAAGTT3；反向引物：5'-TAGGCAGTGACTCGATGAA-3，。PCR反应体系：反应
总体积50jxL，包含Ex Taq（5U/）jl L）,10x Buffer5jxL,dNTP Mixture（各2.5mmol）4jjl L，模板DNA2.5ng，引物各1jjl L；PCR反应条件: ABCB1G2677T：94%：预变性3min,94T变性30s,61T退火30s,72七延伸lmin，共35个循环，72弋再延伸7min,PCR产物片段351bp0 ABCB1C3435T：94T预变性3min,94T变性40s, 52.0T退火lmin,72七延伸lmin，共35个循环, 72T再延伸7min,PCR产物片段246bp o酶切及电泳：用NlaHI限制性内切酶酶切，37T4h后以15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染，紫外灯下观察分型。
1.5统计学方法
应用SPSS18.0软件对数据进行统计分析。采用Hardy-Weinberg进行患者基因型分布的平衡检验，后两个组间基因型和等位基因频率比较采用乂2检验，采用Kolmgorow-Smimov检验及分位数图（Q-Qplot）法对测得的各项血脂指标及其他基本数据进行正态性检验，不符合正态分布的数据通过自然对数转换符合正态分布后，再进行数据分析。服从正态分布的数据以均数土标准差G±s）表示，不服从正态分布的以中位数土四分位数间距（M土Q）表示。不同基因型组间TG、TC、LDL-C以及HDL-C测定值等的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-/检验，方差不齐采用Kruskal-Wallis秩和检验，服药前后对比采用配对/检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1患者的基本资料
对205例患者年龄、病程进行正态性检验，发现符合正态分布。其中，A组患者130例，男80例、女50例，年龄32~94岁、平均（67.00±
12.44)岁，病程3-23个月、平均(12.78±5.93)个月；B组患者75例，男47例、女28例，年龄24~91岁、平均(63.32±15.34)岁，病程3~24个月、平均(13.68±6.17)个月。两组患者的年龄、病程比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)，见表1。
表1患者年龄和病程分布
n
性别
年龄病程男女
A组130805067.00±12.4412.78±5.93 B组75472863.32±15.3413.68±6.17
F  3.500  1.070
P0.0600.300
2.2ABCB1基因G2677T、C3435T基因型及等位基因频率分布
经吻合度检验，患者基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明样本来自同一蒙德尔体，样本具有代表性。205例患者中G2677T位点GG型、GT型、IT型基因频率分别为19.51%、42.44%、3&05%；等位基因G和T 频率分别为40.73%和59.27%。C3435T位点CC 型、CT型、TT型基因频率分别为34.63%、49.76%、15.61%；等位基因C和T频率分别为59.51%和40.49%。
G2677T位点A组与B组等位基因突变率为5&46%与60.67%,A组GG型、GT型、TT型基因频率分别为23.08%、36.92%、40.00%,B组GG型、GT型、TT型基因频率分别为13.33%、52.00%、34.67%；C3435T位点A组与B组等位基因突变率为40.77%和40.00%,A组CC型、CT型、TT型基因频率分别为34.62%、49.23%、16.15%,B组CC型、CT型、TT型基因频率分别为34.67%、50.67%、14.66%0/检验结果显示，A组和B组患者基因G2677T、C3435T 基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2~3。
表2患者基因型分布(G2677T、C3435T)
基因基因型n基因频率/%2X P
G2677T G/G4019.51
G/T8742.44  3.0020.083
T/T783&05
等位基因G40.73
T59.27
C3435T C/C7134.63
C/T10249.760.2160.642
T/T3215.61
等位基因C59.51
T40.49
2.3用药前基因G2677T、C3435T多态性与4项血脂指标的关系
对205例患者用药前4项血脂指标进行正态性检验，发现TG、TC、HDL-C、LDL-C经自然对数转换后符合正态分布。服药前，基因G2677T各基因型患者血浆TG、HDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；TT型患者血浆TC、LDL-G 水平高于GT型患者，差异均有统计学意义(P< 0.05)，而GG型患者TC、LDL-C水平与分别与GT、TT型患者比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。基因C3435T各基因型患者血浆TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)见表4。
A组和B组ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因频率
G2677T基因型C3435T基因型表3
纽
别
JI G/G G/T T/T G T C/C C/T T/T C T (%)(%)(%)(%)(%)(%)(%)(%)(%)(%)
A
130304852
41.5458.46
456421
59.2340.77
组(23.08)(36.92)(40.00)(34.62)(49.23)(16.15)
B
75103926
39.3360.67
263811
60.0040.00
组(13.33)(52.00)(34.67)(34.67)(50.67)(14.66) 2
X  5.2170.1920.0870.023
P0.0740.6620.9570.879
表4阿托伐他汀前ABCBA G2677T、C3435T不同基因型间血脂水平比较（M±Q）
基因基因型n TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L) G2677T GG40  1.60±1.25  4.08±2.140.89±0.23  2.03±1.53 GT87  1.41±1.11  3.49±1.370.76±0.24  1.81±0.91
TT78  1.45±1.29  3.99±2.40*0.87±0.41  2.16±1.73#
C3435T CC71  1.71±1.05  3.70±1.870.82±0.33  1.89±1.46 CT102  1.46±1.24  3.93±2.020.79±0.31  1.96±1.48
TT32  1.29±0.97  3.03±1.770.88±0.21  1.66±1.10与GT型患者比较：#P<0.05
2.4用药后ABCB1基因G2677T、C3435T多态性与4项血脂指标的关系
对205例患者用药后4项血脂指标进行正态性检验，发现用药后TG、TC、HDL-C、LDL-C经自然对数转换后符合正态分布。服药后，基因G2677T 各基因型患者血浆TG水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；GT型患者血浆TC、HDL-C、LDL-C水平低于GG型和TT型患者，差异均有统计学意义（P<0.05），而GG型与TT型患者TC、HDL-C、LDL-C水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）o基因C3435T各基因型患者血浆TG、HDL-C水平比较，差异均无统计意义（P>0.05）；TT型患者血浆TC水平低于CC型和CT型患者，差异均有统计学意义（P<0.05），而CC型与CT 型患者TC水平比较，差异
无统计学意义（P> 0.05）；IT型患者血浆LDL-C水平低于CC型患者，差异均有统计学意义（P<0.05），而CT型患者LDL-C水平分别于CC型、TT型比较无差异（P >0.05）0见表5。
表5阿托伐他汀后G2677T、C3435T不同基因型间血脂水平比较（M±@）
基因基因型n TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L) G2677T GG40  1.29±0.48  4.01±1.44  1.12±0.12  2.22±0.81 GT87  1.37±0.63  3.37±1.27*  1.08±0.32*  1.70±0.80*
TT78  1.26±0.56  3.64±1.26  1.10±0.11  1.92±1.03
C3435T CC71  1.31±0.62  3.79±1.18  1.09±0.13  2.18±0.92 CT102  1.32±0.56  3.62±1.29  1.ll±O.17  1.87±1.00
TT32  1.20±0.50  3.19±1.07*  1.06±0.21  1.69±0.71**与GG、TT型患者比较：”P<0.05；与CC、CT型患者比较:*P<0.05；与CC型患者比较:**P<0.05
2.5用药前后4项血脂指标的比较
对阿托伐他汀用药前后4项血脂水平的差值进行正态性检验，发现用药前后血浆TC、HDL-C、LDL-C水平的差值服从正态分布，而TG用药前后的差值经自然对数转换后也达到正态分布。与用药前相比，用药
后血浆TC、LDL-C水平降低, HDL-C水平升高，与用药前比较差异均有统计学意义（P<0.001）。对于TG指标，由于其用药前后差值不符合正态分布，经自然对数转换后达到正态分布后进行配对/检验，用药前Ln（TG）水平（0.42±0.51）高于用药后Ln（TG）水平（0.23±0.36），差异有统计学意义（P<0.001），见表6。
表6阿托伐他汀前后4项血脂水平比较（M±Q）血脂指标用药前用药后p TG/(mmol/L)  1.46±1.21  1.31±0.56*<0.001 TC/(mmol/L)  3.70±2.07  3.62±1.28*<0.001 HDL-C/(mmol/L)0.82±0.29  1.09±0.16*<0.001 LDL-C/(mmol/L)  1.89±1.38  1.90±0.96*<0.001与用药前比较:*P<0.05
2.6基因G2677T,C3435T位点多态性与阿托伐他汀调脂疗效的关系
ABCB1基因G2677T、C3435T各基因型患者血脂水平差值比较，差异均无统计学意义（P> 0.05），见表7。
人血脂水平用M±Q 表示
表7ABCB1 G2677T 、C3435T 不同基因型间阿托伐他汀用药前后血脂水平差值比较(M±Q/F±s)
基因
基因型
n TG  (mmol/L)
TC  (mmol/L)HDL-C  (mmol/ILI)L-C  ( mmol/L
G2677T
GG
40
0.27 ±1.11A 0.18±0. 91
-0. 21 ±0. 22
0.07±0. 82GT 87
0. 19 ±0. 84A
0.28 ±1.04-0.18 ±0.19
0.18±0. 73
TT
78
0.27 ±0. 82A 0. 43 ± 1. 05
-0.20±0. 260. 33 ±0. 70
C3435T CC 710.26 ±0.74 *
0.18 ±1.03-0.22±0. 260.12 ±0. 80
CT 102
0. 28 ±0. 93a
0.41 ±1.01-0.18 ±0. 220. 29 ±0.71TT
32-0.01 ±0. 95 A
0. 33 ±1.06
-
0.18 ±0.18
0. 22 ±0. 6S
3讨论
本研究探讨了阿托伐他汀的主要代谢酶AB- CB1基因G2677T 、C3435T 多态性与阿托伐他汀降 脂疗效的关系。ABCB1基因(多药耐药基因，
MDR1)编码的P-gp 位于肝细胞、小肠上皮细胞顶
端及近端小管刷状缘，其功能是将药物由细胞内 转运到细胞外，防止药物及其代谢产物积聚细胞 内引起毒性反应。ABCB1基因突变将导致P-gp 表 达异常或功能缺陷⑼，影响药物在体内的代谢,
导致阿托伐他汀不同的疗效和不良反应O
随着药物基因组学和分子遗传学的发展，发
现4BCB1基因在不同种族人中至少超过50个
基因多态性SNPs，其中位于编码区域的C1236T 、G2677T/A
和C3435T 在不同种族人中均有报道，被认为是 影响ABCB1基因功能的3个最常见SNPs，具有重 要意义。C1236T 、G2677T/A 、C3435T 等位基因在
中国人的突变率较高，分别为71. 9% (C1236T)、 50% (G2677T)、12.5% ( G2677A )和 53. 1%
(C3435T)，且三者之间存在明显的连锁不平 衡皿⑷。且有研究发现在女性高脂血症患者中，
ABCB1 34350 T 与阿托伐他汀的疗效有关，服用 阿托伐他汀后，CC 基因型患者LDL-C 下降最少,
而各基因型HDL-C 升高的幅度依次为CC  > CT  > TT [15]。临床上已有ABCB1基因C1236T 与阿托伐
他汀调脂疗效关系的研究，而本研究探讨了 AB-
CB1的另外两个基因位点G2677T 和C3435T 的多
态性与临床阿托伐他汀对降月旨的疗效的相关性。
本研究结果显示，ABCB1基因G2677T 位点在
后4项指标恢复正常人中等位基因突变率为 5& 46%，后4项指标仍有一项及一项以上异
常人中等位基因突变率为60. 67% ； C3435T 位
点在后4项指标恢复正常人和仍有一项及一
项以上异常人中等位基因突变率为40. 77%和
40. 00% ； ABCB1 基因 G2677T 、C3435T  位点基因
型及等位基因频率在后4项指标恢复正常人
和仍有一项及一项以上异常人中分布并无明显
差异。205例患者中，用药前ABCB1基因G2677T
位点1T 型血浆TC 、LDL-C 水平高于GT 型(P<
0. 05) o 用药后ABCB1基因G2677T 位点GT 型血
浆TC 、HDL-C 、LDL-C 水平低于GG 型与TT 型
(P  < 0. 05)；用药后 ABCB1 基因 C3435T  位点 TT
型血浆TC 水平低于CC 与CT 型(P<0.05)，而 CC 型血浆LDL-C 水平高于TT 型(P<0.05)；综
上所述ABCB1基因G2677T 位点和C3435T 位点
SNPs 与血脂水平有关，可为临床提供依据。
经20 mg/d 阿托伐他汀3个月后，血浆TG 、
TC 、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高，说明阿
托伐他汀具有良好的降血脂效果。而前后4项
指标的差值与ABCB1基因G2677T 、C3435T 位点 SNPs 无关，说明ABCB1基因G2677T 位点和
C3435T 位点SNPs 可能与阿托伐他汀降脂疗效
无关。
目前，大部分有关基因多态性对他汀类药物 影响的研究，都只考虑某一种多态性对他汀类药
物的影响，而他汀类药物在体内的代谢、转运、
产生药效的过程十分复杂，影响因素众多，单个 遗传决定因素难以全面反应多态性所致影响，同 时考虑多个基因联合效应更具现实意义"6。阿托
伐他汀的药物基因组学研究是目前冠心病和动脉 粥样硬化领域中的新进展，有关药物代谢酶、
转运体以及脂质代谢相关基因多态性对阿托伐他 汀药物疗效的影响，国内外已有很多研究，但其 仍处于一个起步阶段，缺乏多个基因位点的单倍
体研究，对于突变位点的功能意义研究尚需完善, 缺乏多人种、多种族的大样本研究，缺乏药物转 运体与代谢酶对药动学和药效学影响的联合研 究U"。有报道研究发现影响阿托伐他汀降脂效果