D O I:10.13419/jki.aids.2021.05.02•论著•
干血斑HIV-1核酸定性检测的可靠性研究
姚佳明\陈文先2，潘晓红、郭志宏\丁晓贝\范钦、夏燕\张佳峰1
(1.浙江省疾病预防控制中心艾滋病与性病预防控制所，杭州310051; 2.义乌市疾病预防控制中心微生物检验科，浙江义乌322000)
摘要：目的探索干血斑(D B S)核酸定性检测用于H I V-1感染诊断的可靠性方法同步采集参加自愿咨询检测人员的D B S样本和配套血清样本各230份，D B S样本用于H I V-1核酸定性检测，血清样本进行常规抗体检测，分
析比较两种方法的检测结果。结果D B S初次核酸定性结果与血清初次抗体检测结果一致率为98.70%，/^PPa值为
0.93，经复核及随访复检后两种方法最终判断结果完全一致，一致率为100%。其中2例抗体不确定样本其核酸定性
检测为阳性，随访后W B条带进展，确证为H I V-1抗体阳性；有1例抗体阴性样本其首次核酸定性检测为阳性，双份复
核为阴性：结论D B S核酸定性结果与常规血液抗体检测的感染诊断结果一致性好，且流程简便、准确性高，但需考
虑不确定范围。
关键词：艾滋病病毒；干血斑；核酸检测；抗体检测
核酸检测结果阳性参考值阴性中图分类号：R 512.91;R 373.9 文献标志码：A文章编号：1672-5662(2021 )05-0446-04
Reliability of the result for HIV-1 qualitative nucleic acid test based on dried blood spots YAO Jiaming', CHEN
Wenxian:,PAN Xiaohong', GUO Zhihong1, DING Xiaobei', FAN Qin1, XIA Yan', ZHANG Jiafeng'. (1. Department o f
HIV/AIDS & STD Control and Prevention, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou
310051, China;2. Microbiological laboratory, Yiwu Municipal Center for Disease Control and Prevention, Yiwu 322000)
C o r r e s p o n d i n g a u t h e r:Z H A N G Jiafeng, Email: **************
Supported b y Mega-Projects o f National Science Research for the 13th Five-Year Plan (2017Z X10201101)
Abstract: Objective T o investigate the reliability o f H I V-1qualitative nucleic acid test using dried b l o o d spots
(D B S)to diagnose H I V-1infection. Methods D B S s a m p l e s a n d paired s e r u m s a m p l e s w e r e collected synchronously
f r o m230voluntary attendees seekin
g counselling a n d testing. T
h e D B S s a m p l e s w e r e use d for the H I V-1qualitative
nucleic acid test, a n d the s e r u m sa m p l e s w e r e used for routine antibody detection. T h e results o f the t w o m e t h o d s w e r e
analyzed a n d c o m p a r e d.Results T h e concordant rate o f first test results b e t w e e n H I V-1qualitative nucleic acid test
using dried blo o d spots a n d paired s e r u m antibody test w a s98.70%,a n d the Kappa value w a s0.93. After c h e c k a n d
follow-up reexamination, the t w o m ethods' final j u d g m e n t results w e r e entirely consistent, with a constant rate o f 100%.
T w o s a m p l e s with indeterminate W e s t e r n blotting (W B) results w e r e initially tested positive in H I V-1qualitative nucleic
acid assay. T h e s e t w o s a m p l e s w e r e confi r m e d to be H I V-1antibody positive after follow-up, with W B b a n d i n g patterns
progressed. W i t h s e r u m antibody negative, another s a m p l e w a s initially tested positive in H I V-1qualitative nucleic acid
assay but f o u n d negative in the t w o parallel samples' reexamination. Conclusion T h e H I V-1qualitative nucleic acid test
using D B S is consistent with those o f routine blood antibody tests to diagnose H I V-1infection. I t is characterized b y
simple Process a n d high accuracy, but the uncertainty range should b e taken into account.
Keywords: H I V; Dried blood spots; Nucleic acid test; A n t i b o d y test
干血斑（Dried Blood Spots，DBS)技术最初建立 应用于新生儿代谢紊乱筛查1，国内研究学者开展 DBS在HIV-1抗体筛查2、基因型耐药检测1等方面 的评价研究，近年来又探索应用D I3S抗体检测方法 的优化4于2019年7月1日实施的新版《艾滋病和
收稿日期：2020-07-27；修回日期：2020-09-1()
基金项目：国家“十三五”科技重大专项(2017Z X10201101)
第一作者简介：姚佳明（1995—），男，浙江省杭州市人，从事艾滋病检测工作
通信作者.•张佳峰，副主任技师，Email 丨*********** 艾滋病病毒感染诊断(WS293-2019)》[5]中指出：成 人、青少年及18月龄以上儿童在HIV抗体筛查试验 有反应前提下，若核酸定性试验阳性或核酸定量试 验>5 000拷贝/mL即可诊断。但国内有关DBS在 HIV核酸定性检测方面的报道较少：本研究旨在探 索DBS核酸定性检测在HIV感染诊断上的可靠性，为扩大检测提供相关支持。
1对象与方法
1.1对象2019年9月至2020年5月，自愿咨询检 测门诊的干血斑制备合格的MSM :
1.2方法由义乌市疾病预防控制中心工作人员
对其采集静脉血，平行制备干血斑和收集血清，分别 进行核酸定性检测和抗体检测。干血斑核酸定性检 测在浙江省疾病预防控制中心艾滋病确证中心实验 室完成，抗体检测由义乌市疾病预防控制中心工作 人员完成。
1)
干血斑制备及核酸定性检测：干血斑采集卡 购自北京金豪制药股份有限公司。用200 pL 移液 器吸取80 |xL 全血滴到血样采集卡上，全血样本覆 盖整个虚线区域，单个样本制作4个血斑。血样采 集卡水平置于生物安全柜中干燥>4 h 3充分干燥后， 血样采集卡保存于内置干燥剂和湿度指示卡的独立 包装自封袋内，排空袋内空气，_20丈保存，218丈运 输至浙江省疾病预防控制中心。
实验前先将装有干血斑采集卡的自封袋在室温 下平衡1小时。在生物安全柜内使用酒精棉球擦拭 打孔器头部，酒精灯灼烧后在干净滤纸片上预打孔， 观察滤纸片上无烧焦样后，沿着干血斑边缘取一片 直径为6 mm 带有DBS 的滤纸片于1.5 mL 离心管内： 打孔完成后，依次在每个离心管中加人1 200 pL 样 本
前处理液，样本前处理液为COBAS ® AmpliPrep /
COB  AS ® TaqMan ® Specimen  Pre-Extraction  Reagent (SPEX )。56 X ；孵育10分钟后取上清1 000 (iL 转移 到S -tube 。使用罗氏公司的COBAS ® AmpliPrep 自 动化处理样本；COBAS ® TaqMan ® Analyzer  对 DBS  中 的HIV -1总核酸扩增以及定性检测，试剂盒为仪器 配套的 COBAS ® AmpliPrep /COBAS ® TaqMan ® HIV -1
Qualitative  Test , v 2.0。该试剂盒利用双标记寡核苷 酸探针检测HIV -1基因组上gag 和LTR 区高度保守 区，可同时检测HIV -1 RNA 和前病毒DNA 。
2)
抗体检测：按照《全国艾滋病检测技术规范
(20丨5年修订版）》[6:。HIV 抗体筛查试剂为美国
Alere 公司的HIV 抗体检测试剂（胶体硒法）和BI 0-
RAD 公司的HIV  (1 +2)抗原抗体酶联免疫诊断试剂
盒（Genscreen  HIV  Ag-Ab  ULTRA )。如抗体筛查结
果有反应，进行HIV 抗体WB ，使用试剂为新加坡M P 生物医学亚太私人有限公司生产的HIV ( 1+2型）抗 体检测试剂盒（蛋白印迹法）。HIV 抗体不确定者随 访检测明确感染状态。
1.3统计分析采用SPSS  vl 9.0软件分析两种检测 方法的值。
2结果
2.1 DBS 核酸定性检测结果共收集检测230份
DBS 样本，24份HIV -1核酸定性检测结果为“检测 到 ”（Detected  )，样本 Ct  值中位数为 28.20 (20.90~ 31.90)，其中2例首次检测为抗体不确定，随访后为 HIV -1抗体阳性；
206份结果为“未检测到”（Not Detected  )，其中2例抗体初筛为阳性，抗体WB 为阴 性，样本编号“19406373535”首次核酸定性检测为阳
性(Ct 值=36.30)，扩增曲线非典型S 型，相对荧光强
度很低（<5 )，双份复核均为阴性，其抗体筛查为阴 性，详见图1。
2.2血清抗体检测结果DBS 对应研究对象的血清样本抗体初筛阴性204例，初筛阳性26例。26例筛 查阳
性样本经过HIV 抗体复检和WB 试验，其中22 例为HIV -丨抗体阳性，2例HIV 抗体阴性,2例HIV 抗 体不确定。
2例抗体不确定样本的DBS 核酸定性结果均为 阳性。样本编号“19406391478”病例为男性，近一年 内未接受HIV 检测，近3个月内有过无保护性行为。 首次采血在2020年I 月7日，酶联免疫法检测有反 应(S /C 0值为12.10)，胶体砸法有反应；1月14日进 行WB ，WB 条带显示只有gp  160; 3月3日进行随访检 测，WB 条带明显进展，结果为p i 7，P 24, P 31, gP 41，
P 51, P 66，gp  120，gp  160，抗体确证试验结果为HIV -1 抗体阳性。样本编号“19406355224”病例在2019年 9月接受过HIV 抗体检测，结果阴性，近3个月发生 过无保护性行为。酶联免疫法检测有反应(S /C 0值 为9.23)，胶体硒法有反应；2019年11月7日其WB 条带只有gpl 60, 11月14日WB 条带进展，结果为
p 24,gpl 20，gpl 60，为 HIV -1 抗体阳性。
2 例样本（编号“ 19406360929” “ 19406389267” )
酶联免疫法检测有反应，胶体硒法无反应，抗体
与核酸定性检测均为阴性，详见表1。
2.3两种检测方法的一致性比较平行采集检测
230份DBS 和血清样本，首次检测结果核酸定性检测
和抗体检测结果一致率为98.70%, 值为0.93。
考虑到复核及随访复检的最后检测结果后，两种方 法最终判断结果一致率为100%。
2.4不同检测方式时间周期HIV 抗体检测一般需 经过HIV 筛查（快速法和ELISA )，筛查阳性后进行
HIV 抗体确证试验。HIV 抗体筛查(快速法)所需时 间约为30 min ，ELISA 所需时间约为3 h 。理想状态 下，获得HIV 抗体WB 结果耗时最短约为4.5 h ，最长 约为25 h ；如出现HIV 抗体WB 不确定结果，持续时 间将达到2周以上。核酸定性检测耗时约为6 h 。
Target (HIV)
QS/IC
+ Target(HIV)
— QS/IC
-Target (HIV) "QS/IC
0    5 10 15 20 25 30 35 40 45
0    5 10 15 20 25 30 35 40 45
Cycles Cycles 注：A ：首次核酸定性检测结果;B /C ：双份复检的核酸定性检测结果。
图1首次核酸定性检测假阳性样本（编号“19406373535”）的荧光P C R 扩增曲线
表1抗体检测和核酸定性检测不一致结果的比较
0    5 10 15 20 25 30 35 40 45
Cycles
样本编号
酶免
(S/CO)胶体砸法_W B 条带
核酸定性(Ct)
首次
随访结果
1940639147812.10有反应gpl60p 17,p 24,p 31,g p 41,p 51,p 66,g p 120,g p 16020.90194063552249.23有反应gpl60p24,gpl20,gpl60
23.30
194063735350.25无反应H I V 抗体阴性
无特异性条带①36.30②阴性③阴性
19406360929  1.09无反应无特异性条带无特异性条带阴性19406389267
1.02
无反应
无特异性条带
无特异性条带
阴性
注：表中①②③分别表示同份样本的3次检测结果。
3讨论
联合国艾滋病规划署提出了 “90-90-90”目
标[7]，其中第一个“90”指90%感染者知晓自身感染 状态，然而部分高危人因担心隐私暴露和社会歧 视问题，对常规的HIV 检测存在抵触心理。自我采 样传递检测由个人完成样本采集后，以邮寄或投放 在样本回收箱等方式传递至实验室，由专业人员完 成检测，个人通过唯一编码获取检测结果，能有效促 进高危人主动检测，实现早发现。高先等[8]对自 助采样包所采集的样本进行检测，发现干血斑较高 的检测效能，不仅适合自然人，也适合高危人。 本研究发现基于干血斑的HIV -1核酸检测用于感染 诊断具有较高的可靠性，可用于HIV 感染疑似样本 的传递检测，也可用于高危人的扩大检测，作为传
统HIV 抗体检测方式的有益补充。
本研究对血清和干血斑分别进行抗体检测和核 酸检测，两种方法在结果上一致性良好，进一步证实 干血斑核酸检测在HIV 诊断中的可靠性。然而两种 方法在检测结果上仍存在差异，试剂的灵敏度和特 异性是影响因素之一，同时HIV 诊断标志物也是重 要的影响因素，核酸标志物较抗体更早出现，可在感 染后一■周左右被检出_9]。
本研究发现的1例抗体不确定案例在随访56天 后才能最终确证阳性，综合其两次WB 条带情况及
采样时间，认为该病例首次采样时正处于感染早期，
DBS 核酸定性检测方法相比抗体检测更早发现HIV 早期感染者。干血斑结合核酸定性的检测模式，具 有特异性好、灵敏度高等优点，采用的检测靶标稳定 且针对HIV 总核酸(RNA 和前病毒DNA )，检测周期 较常规抗体检测更短，结果更加明确。而常规抗体 检测需要经历筛查、复检和确证，虽然方法成熟，流 程完善，结果可靠，但不足在于检测周期相对漫长, 增加受检者心理负担。
核酸检测假阳性的原因可能是偶发的非特异性 扩增，或实验过程中的气溶胶污染。由于PCR 具有 极高的灵敏性，实验过程中极其微量的气溶胶污染 即可造成核酸检测假阳性的产生。本研究中1例核 酸假阳性案例，怀疑可能在干血斑核酸提取前处理 过程中发生了气溶胶污染，在后续的PCR 过程中微 量的核酸被信号放大并被仪器判读为“检测到”。在 缺少抗体检测结果参考的前提下，最终结果的判断 将会出现偏差。
WHO  1()12018年在婴儿早期诊断中建议使用不 确定范围提高基于核酸的诊断检测准确性，其中提
到罗氏 COBAS ® AmpliPrep /COBAS ® TaqMan ®HIV-l
Qualitative  Test ，V 2.0检测试剂盒Ct 阈值33为最佳不 确定范围1 n]。通过比对抗体检测结果和重复试验核 酸确定本研究样本编号为“19406373535”的样本其 首次定性检测结果为假阳性。因此有必要在试剂说
5
0 5 0 4 4 3 3X
J I S d i U J <L o u (L o s l l ;J O I l l j
5 0 5 0
2 2 115 0 50
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—H
j
明书中说明检测灰区的存在，提醒使用者谨慎判读 结果。《全国艾滋病检测技术规范》2015年修订版6和2020修订版121中提到核酸定性检测结果显示“有 反应”或“检测到”，应报告本次实验核酸阳性。本研 究发现的核酸检测假阳性案例，提醒我们在进行核 酸定性检测时要特别关注Ct值，当使用罗氏HIV定 性检测试剂盒出现检测结果Ct值>33的情况时，应 进行双份复核。建议在《全国艾滋病检测技术规范》后续修订时提醒HIV核酸定性检测存在不确定范围 或者需要复检的情况。
参考文献：
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订版）[Z]. 2020.
d言息
《中国艾滋病性病》杂志2021年征订启事
《中国艾滋病性病》(原名《中国性病艾滋病防治》)杂志是国家卫生健康委员会主管，中国性病艾滋病
防 治协会和中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心联合主办的，唯一专门介绍艾滋病预防与控制最 新科研动态，成果和有关信息的学术刊物。为中国科技论文统计源期刊（中国科技核心期刊），《中国学术期 刊综合评价数据库》来源期刊，RCCSE中国核心学术期刊，中国精品科技期刊，并被美国化学文摘(CA)及数据 库、WHO西太平洋地区医学索引（WPRIM)收录，入编《中文核心期刊要目总览》(第9版)之预防医学、卫生学 类的核心期刊。本刊1995年创刊，国内外公开发行，国内统一连续出版物号为:CN I1-4818/R，国际标准连续 出版物号为：丨SSN 1672-5662。
本刊为月刊，每月26日出刊，大16开本，112页，每期定价20元，全年240元(含邮资）。
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