收稿日期：2009-10-26。收修改稿日期：2010-01-15。
中南大学人才引进基金(No.761122990)、南京大学配位化学国家重点实验室开放基金资助。
＊
通讯联系人。E -mail ：zhang_shch@yahoo ；会员登记号：S060019621M 。第一作者：周建良，男，45岁，副教授；研究方向：生物无机化学及金属簇合物化学。
新型三元铜配合物的合成、晶体结构及与DNA 的相互作用
周建良1
春晓改1
周琳姣2
陈
云3
张寿春＊,1,2
(1中南大学化学化工学院，长沙
410083)
(2南京大学配位化学国家重点实验室，南京210093)
(3湖南大学化学化工学院，长沙410082)
摘要：合成了一种新型的三元铜配合物[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O ，(Dppz 为二吡啶并[3，2-a ；2′，3′-c]吩嗪，Gly 为L -甘氨酸)。该配合物晶体属于单斜晶系，P 21/c 空间，a =2.1588(4)nm ，b =0.7216(13)nm ，c =1.4219(3)nm ，β=108.648(2)°。配合物分子中五配位的中心金属铜离子处于变形四方锥配位环境。紫外吸收光谱与荧光光谱分析表明，该配合物通过嵌入模式与DNA 结合，并在还原剂存在下能显著的切割超螺旋DNA 。
关键词：二吡啶并[3，2-a ；2′，3′-c]吩嗪；三元铜配合物；DNA 结合；DNA 切割中图分类号：O614.121
文献标识码：A
文章编号：1001-4861(2010)04-0645-06
Synthesis,Crystal Structure of A New Ternary Copper 髤Complex
and Its Interaction with DNA
ZHOU Jian -Liang 1CHUN Xiao -Gai 1ZHOU Lin -Jiao 2CHEN Yun 3ZHANG Shou -Chun ＊,1,2
(1School of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083)(2The State Key Laboratory of Coordination Chemistry,Nanjing University,Nanjing 210093)(3School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan University,Changsha 410082)
Abstract:A new ternary copper 髤complex,[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O (dppz=dipyrido [3,2-a:2′,3′-c]phenazine,Gly =L -glycine),has been synthesized and structurally characterized.The complex crystallized in a monoclinic system with space group P 21/c ,a =2.1588(4)nm,b =0.7216(13)nm,c =1.4219(3)nm,β=108.648(2)°.The five -coordinate copper 髤center is a distorted square pyramid.Absorption spectra and fluorescence spectra showed that there was interaction between the copper 髤complex and DNA through an intercalative mode.The complex exhibited efficient DNA cleavage activity in the presence of ascorbate.CCDC:767873.
Key words:dppz;ternary copper 髤complex;DNA binding;DNA cleavage
近年来，过渡金属配合物在作为抗癌药物，DNA 结构探针等方面展现出了巨大的应用前景，因
而受到了人们的广泛重视[1-5]。研究金属配合物与核酸，特别是与DNA 的作用方式与机理，对于探索配合物在生物医学相关领域的应用具有重要的理论指导意义。铜是生物正常生长发育所必需的微量元素之一，是多种酶系统的活化剂，辅因子或组织成
分，参与和调节生物的多种生命活动过程。铜配合物由于具有各种重要的生物活性如抗肿瘤活性[6-7]、抗菌作用[8]及作为人工核酸酶[9-10]而已成为生物无机化学热门课题之一。Sigman 等[11]1979年首次发现1，10-邻菲咯啉-铜配合物在还原剂和H 2O 2存在条件下能有效切割DNA 。自此以后，对铜配合物与DNA 相互作用的研究方兴未艾，已报道合成出了一
第26卷第4期2010年4月
Vol ．26No ．4645-650
无机化学学报
CHINESE JOURNAL OF INORGANIC CHEMISTRY
第26卷无机化学学报
系列具有核酸酶活性的铜配合物，如单核铜配合物[12-15]、双核铜配合物[16-18]及多核铜配合物[19-20]等。
氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，氨基酸铜配合物切割DNA的研究受到了人们的广泛关注[14,21-23]。本文基于探寻具有更高核酸酶活性的铜配合物，选用具有大平面芳香结构的1，10-邻菲咯啉衍生物(Dppz)和人体必须的氨基酸(L-甘氨酸)为配体，合成了一种新型的三元铜配合物，并通过电子吸收光谱，荧光光谱和琼脂凝胶电泳方法研究了此配合物对DNA的键合及切割作用。
1实验部分
1.1试剂与仪器
二吡啶并[3，2-a；2′，3′-c]吩嗪(Dppz)按文献[24]合成，无水乙醇、无水乙醚、水合硝酸铜及氢氧化钠均为分析纯试剂，使用时未经纯化处理。L-甘氨酸购自Aldrich；pUC19DNA购自MBI Fermentas；小牛胸腺DNA(CT DNA)、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)及溴化乙锭(EB)均购自Sigma。
红外光谱由AVATAR-360型红外光谱仪测定(KBr压片，4000~500cm-1)，元素分析使用Vario EL Ⅲ型元素分析仪测定，紫外-可见光谱在UV-3100型光谱仪上测定，荧光光谱利用AMINCO Bowman Series2型荧光光谱仪测定。DNA凝胶电泳实验在BIO-RAD电泳仪上完成，并通过DigiDoc-ItTM系统成像。
1.2配合物的合成
搅拌条件下将5mL含8mg的NaOH(0.2 mmol)水溶液加入到含15mg L-甘氨酸的5mL(0.2 mmol)水溶液当中，然后加入5mL含48.3mg Cu(NO3)2·3H2O(0.2mmol)水溶液，搅拌几分钟后，缓慢滴加10mL含58.8mg(0.2mmol)Dppz的无水乙醇溶液，滴加完毕后于40℃下反应3h。冷却至室温，有深蓝沉淀析出，抽滤，用无水乙醇及无水乙醚洗涤，自然干燥。滤液于室温下静止1周后析出深蓝块状单晶，产率82%。红外分析结果(KBr压片，cm-1)：3424，3083，1626，1580，1384，732；元素分析结果(括号内为计算值)/%：C，47.33(47.20)；H，3.25(3.34)；N，16.46(16.52)。
1.3晶体结果测定
配合物的晶体衍射数据在Bruker Smart Apex CCD衍射仪上，用经石墨单器单化的Mo Kα射线(λ=0.071073nm)作为衍射光源，在293(2)K 下，以φ-ω扫描技术进行收集。衍射数据用SAINT 程序上进行还原[25]，并用SADABS程序对衍射强度数据进行吸收校正[26]。单晶结构采用直接法以SHELXS程序获得。用SHELXL程序对全部非氢原子坐标及各向异性参数进行全矩阵最小二乘法修正，氢原子由理论加氢法得到。配合物的详细晶体学数据列于表1。
CCDC：767873。
表1配合物的晶体学数据
Table1Crystal data and structure refinement for[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)]·NO3·H2O
Empirical formula C20H18CuN6O7F(000)1060
Formula weight517.94Crystal size/mm0.22×0.20×0.18
T/K273(2)θrange for data collection/(°)  1.99~28.23
Crystal system Monoclinic Limiting indices-28≤h≤25,-9≤k≤9,-18≤l≤17 Space group P21/c Reflection collected/unique(R int)12535/5035(0.0558)
a/nm  2.1588(4)Absorption correction Empirical
b/nm0.7216(13)Refinement method Full-matrix least-squares on F2
c/nm  1.4219(3)Data/restrains/parameters5035/8/334
β/(°)108.648(2)Goodness-of-fit on F2  1.004
V/nm3  2.0988(7)Final R indices[I>2σ(I)]R1=0.0477,wR2=0.1297
D c/(Mg·m-3)  1.639R indices(all data)R1=0.0782,wR2=0.1443
Absorption coefficient/mm-1  1.099Largest diff.peak and hole/(e·nm-3)381and-631
1.4[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)]·NO3·H2O与DNA
之间的作用
1.4.1电子吸收光谱
取一定量的CT DNA用50mmol·L-1NaCl/5 mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.2)溶解，测得该溶液的电子吸收光谱图，在260和280nm处的吸收
646
第4期周建良等：新型三元铜配合物的合成、晶体结构及与DNA 的相互作用
强度之比约为1.9，表明该DNA 样品不含蛋白质[27]。DNA 溶液的浓度通过测定在260nm 处的吸光度来确定(DNA 在260nm 处的摩尔吸光系数ε260为
6600L ·mol -1·cm -1[28])。将DNA 溶液分别按r =0、0.2、
0.4、0.6、0.8的比值(r =n DNA /n complex )加入到[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O (20μmol ·L -1)溶
液当中，记录
溶液紫外曲线的变化。
1.4.2荧光光谱
将1.0mmol ·L -1配合物溶液(用5mmol ·L -1
Tris -HCI/50mmol ·L -1NaCI 缓冲液溶液配制)逐渐滴加到含0.1mmol ·L -1DNA 和10μmol ·L -1EB 的混
合溶液中，在室温下测定每次滴加样品后的荧光光谱(激发波长为520nm ，发射波长为600nm)。1.4.3凝胶电泳实验
将超螺旋200ng pUC19DNA 与一定量的配合物混合，在其中加入浓度为配合物100倍的抗坏血酸溶液，用pH 为7.4的Tris -HCl/NaCl 缓冲溶液定溶到10μL ，在310K 的水浴中恒温反应1h 。加入2μL 的上样缓冲液(30mmol ·L -1EDTA ，36%丙三醇
0.05%二甲苯青，0.05%溴酚蓝)终止反应。利用EB 染的1.0%琼脂糖胶电泳分析切割结果。电泳液为TAE 缓冲液(40mmol ·L -1Tris -HAc/1mmol ·L -1EDTA)，电泳图用UVP 凝胶成像系统分析。
2
结果与讨论
2.1
晶体结构
[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O 的晶体结构如图
1所示，主要的键长和键角分别列于表2和表3。在该配合物中，中心金属Cu 髤离子处于变形四方锥的配位环境中，四方锥的锥底由Dppz 的2个氮原子(N(1)、N(2))及甘氨酸上的2个原子(O(1)、N(5))共同组成，四方锥的轴向位置为水分子中的氧原子
(O(3))。锥底平面上的4个配位原子与金属中心离子Cu(1)形成的化学键分别为Cu(1)-N(1)、Cu(1)-N(2)、Cu(1)-N(5)和Cu(1)-O(1)，其键长分别为0.1997(2)、
表2
[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O 的主要键长
Table 2Selected bond distance (nm)for [Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O
Cu(1)-N(1)0.1997(2)N(3)-C(5)0.1320(3)C(2)-C(3)0.1374(4)Cu(1)-N(2)0.2021(2)N(3)-C(6)0.1358(3)C(6)-C(7)0.1421(4)Cu(1)-N(5)0.2000(3)N(4)-C(12)0.1325(3)C(6)-C(11)0.1410(4)Cu(1)-O(1)0.1941(2)N(4)-C(11)0.1357(3)C(11)-C(10)0.1425(4)Cu(1)-O(3)0.2286(3)N(5)-C(20)0.1477(5)C(12)-C(5)0.1422(4)N(1)-C(1)0.1330(4)O(1)-C(19)0.1270(4)C(12)-C(13)0.1467(4)N(1)-C(18)0.1352(3)O(2)-C(19)0.1248(4)C(17)-C(18)0.1440(4)N(2)-C(16)0.1331(4)O(5)-N(6)0.1212(3)C(19)-C(20)
0.1481(6)
N(2)-C(17)
0.1350(3)
O(6)-N(6)
0.1140(6)
O(1)-Cu(1)-N(1)92.32(9)O(1)-C(19)-C(20)117.9(3)O(1)-Cu(1)-N(5)84.63(12)O(1)-C(19)-O(2)121.0(4)O(1)-Cu(1)-N(2)172.54(10)N(1)-C(18)-C(4)122.6(3)N(1)-Cu(1)-N(5)171.01(11)N(1)-C(18)-C(17)115.7(2)N(1)-Cu(1)-N(2)81.69(9)N(1)-C(1)-C(2)122.9(2)N(1)-Cu(1)-O(3)94.71(15)N(4)-C(11)-C(6)
weight的搭配122.0(2)N(2)-Cu(1)-O(3)91.15(13)N(4)-C(11)-C(10)119.5(3)N(5)-Cu(1)-N(2)100.63(12)C(1)-N(1)-Cu(1)128.32(18)N(5)-Cu(1)-O(3)93.94(16)C(17)-N(2)-Cu(1)
112.55(18)
O(1)-Cu(1)-O(3)
93.77(14)
C(19)-O(1)-Cu(1)
115.2(2)
表3[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·0.5H 2O 的主要键角
Table 3
Selected bond angle (°)for the [Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O
图1[Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3·H 2O 的分子结构图
(椭球几率30%)
Fig.1
Molecular structure of [Cu(Dppz)(Gly)(H 2O)]·NO 3
·H 2O viewed with 30%ellipsoid probability
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第26卷无机化学学报
0.2021(2)、0.2000(3)和0.1941(2)nm，其中中心铜离子与甘氨酸分子形成的2个化学键Cu(1)-O(1)和Cu(1)-N(5)键长与[Cu(Phen)(L-Gly)(H2O)]·NO3·1.5H2O 中的Cu-O和Cu-N(甘氨酸上的氧氮原子)的平均键长(分别为0.1920(5)和0.1984(6)nm)基本相似[29]。Cu(1)-O(1)的键长(0.1941(2)nm)比Cu(1)-O(3)的键长(0.2286(3)nm)更短，表明中心铜离子与甘氨酸中的羧基氧原子的配位能力比与轴向水分子的配位能力更强。配合物的键角数据表明，中心金属Cu髤离子所处的四方锥锥底为轻微扭曲的平面四边形，如N(1)-Cu(1)-N(5)和N(2)-Cu(1)-O(1)键角分别为171.01(11)°和172.54(10)°，均小于180°。配合物中的2个Cu-N(Dppz)键Cu(1)-N(2)和Cu(1)-N(1)的键长分别为0.2021(2)和0.1997(2)nm，N(2)-Cu(1)-N(1)键角为81.69(9)°，其值与文献报道中的一些菲咯啉-配合物中相应的键长与键角相似[12]。
2.2[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)]·NO3·H2O与DNA
之间的作用
2.2.1紫外-可见吸收光谱
紫外-可见吸收光谱在DNA键合研究中是很有用的一种方法。如图2所示为配合物[Cu(Dppz) (Gly)(H2O)]·NO3·H2O在有DNA和DNA不存在情况下的吸收光谱。通常，配合物溶液中加入DNA后，如果配合物的吸收峰强度减少，波长红移，可以认为这是配合物插入DNA的特征之一[30]。如谱图所示，当配合物溶液中加入DNA后，随着DNA溶液的增加，配合物的吸收强度减弱，即配合物在275、359与377nm处的吸收都发生了一定程度的减效应，并且波长有一定的增加，这可能归因于该配合物插入到DNA的碱基对中，插入作用使配合物的平面芳香族生团(插入配体)与DNA的碱基发生π→π*堆积，插入配体的π*空轨道与碱基的π电子轨道发生耦合，耦合后的π*轨道因部分填充电子，使π→π*跃迁几率减少，产生减效应[31]。2.2.2荧光光谱
荧光光谱法已广泛地用于研究配合物与DNA 的相互作用。溴化乙锭(EB)是一种弱荧光试剂，在缓冲溶液中由于溶剂分子的淬灭而发射出较弱的荧光强度。当EB分子插入到DNA结构中时，荧光强度明显增强。但当有一个能取代键合的EB或能破坏DNA二级结构的分子加入时，这种强的荧光就会发生淬灭或部分淬灭[32-33]，因此EB可作为一种测定DNA结构的光谱探针。如图3所示，当加入配合物[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)]·NO3·H2O以后，随着配合物浓度的增加，CT DNA-EB溶液的荧光强度逐渐降低，这表明该配合物可能是通过嵌入方式结合到DNA上并将EB从DNA结构中取代下来[34]。
2.2.3DNA切割活性研究
质粒DNA一般有3种构型：第1种是共价闭环超螺旋DNA(formⅠ)，其结构比较紧密；第2种是开环缺刻型DNA(formⅡ)，当超螺旋DNA的一条链上出现一个缺刻时就是这种构型；第3种是线型DNA(formⅢ)，当超螺旋DNA的2条链在同一位置断裂时，DNA就完全放开成线状。3种构型的DNA由于立体构型不同，通常在琼脂糖凝胶中的迁移率就会不同，一般Ⅰ型速率最快，Ⅲ型次之，Ⅱ型最慢。
在pH7.4、310K时，配合物浓度对pUC19
图2配合物与DNA相互作用的紫外-可见光谱图Fig.2Absorption spectra of the complex in the absence (---)and presence(——
—)of increasing amounts of CT DNA
图3配合物与DNA相互作用的荧光光谱图Fig.3Fluorescence emission spectra of the CT DNA-EB system in the absence(---)and presence(——
—) of the complex
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第4期
DNA切割效率的影响如图4和表4所示。当只加入抗坏血酸还原剂(H2A，第2泳道)或配合物(第3泳道)时，DNA发生很微弱的裂解。而在配合物中同时加入H2A作还原剂时，配合物对pUC19DNA的切割作用明显增强，并且随着配合物浓度的增大，Ⅰ型DNA的含量逐渐减少，Ⅱ型DNA的含量逐渐增加。当配合物的浓度增大至12.0μmol·L-1时(第9泳道)，开始出现Ⅲ型DNA，而配合物浓度为16.0μmol·L-1时(第10泳道)，Ⅰ型DNA基本消失，Ⅲ型DNA含量达到5.7%，这表明在以抗坏血酸作还原剂时，配合物[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)·NO3·H2O具有显著的DNA切割活性。当配合物的浓度均为16.0μmol·L-1时，第10泳道(有H2A)中的DNA切割效率远高于第3泳道(无H2A)，这表明，只有在H2A等还原剂存在的条件下，配合物才对DNA具有较高效率的切割作用。
图4配合物浓度对pUC19DNA切割活性的影响
Fig.4Cleavage of supercoiled pUC19DNA by
[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)NO3H2O at different
concentration in the presence of ascorbic
acid(H2A)
表4配合物浓度对DNA切割活性的影响
Table4Data of pUC19DNA cleavage at different concentrations of[Cu(Dppz)(Gly)(H2O)]·NO3·H2O
Serial No.a Reaction condition
Form/%
ⅠⅡⅢ
1DNA control97.8  2.2
2DNA+H2A86.513.5
3DNA+complex(16.0μmol·L-1)86.014.0
4DNA+H2A+complex(1.0μmol·L-1)74.026.0
5DNA+H2A+complex(2.0μmol·L-1)81.118.9
6DNA+H2A+complex(4.0μmol·L-1)65.734.3
7DNA+H2A+complex(6.0μmol·L-1)58.341.7
8DNA+H2A+complex(8.0μmol·L-1)53.846.2
9DNA+H2A+complex(12.0μmol·L-1)35.862.6  1.6 10DNA+H2A+complex(16.0μmol·L-1)  1.692.7  5.7 a The serial number is the same as the lane number shown in Fig.4.
周建良等：新型三元铜配合物的合成、晶体结构及与DNA的相互作用
3结论
本文报道了一种以二吡啶并[3，2-a；2′，3′-c]吩嗪(Dppz)为主配体，L-甘氨酸为辅配体的新型三元铜配合物，其中心金属Cu髤离子为变形四方锥构型，该配合物能通过嵌入方式与DNA结合，并在抗坏血酸作还原剂时，配合物能显著的切割超螺旋的pUC19DNA。
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