•基础研究•
NLRP3过表达对非小细胞肺癌不同
细胞系生物学行为的影响
杜卫华王昌媛3，信芳杰4，宋文5，杨镇翠2，赵鹏4，宗金宝6
（1青岛大学医学部，山东青岛266101；.青岛大学附属医院检验科，山东青岛266500；
3.青岛市市立医院皮肤科，山东青岛266011；.青岛大学附属医院病理科，山东青岛266500；
5.青岛大学附属医院消化内镜中心，山东青岛266071；
6.青岛市中医医院和青岛大学附属青岛市海慈医院检验科，山东青岛266034）
摘要：目的探讨慢病毒介导的NLRP3过表达对非小细胞肺癌（NSCIC）A549细胞和NC-H460细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并比较两种细胞系生物学行为的差异，探索NLRP3成为药物开发新靶点或潜在调节因子的可能性.方法设计并构建NLRP3过表达慢病毒载体，用过表达慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体分别感染人NSCLC A549和NC-H460细胞，获得NLRP3过表达细胞组（O/E组）和阴
性对照细胞组（CON组）.采用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwcll侵袭实验、流式细胞技术分别检测两组细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的情况.结果NLRP3过表达对A549细胞的增殖起促进作用，抑制NC-H460细胞的增殖，其过表达促进A549细胞的迁移和侵袭，抑制A549细胞的早期凋亡.NLRP3过表达对NC-H460细胞的迁移、侵袭、凋亡均无明显影响.结论NLRP3过表达促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制早期凋亡，其过表达对NC-H460细胞的增殖有抑制作用.由此可以推断NLRP3可能成为NSCLC药物开发的新靶标或潜在调节因子.
关键词:NLRP3；过表达；非小细胞肺癌；增殖；迁移；侵袭；凋亡
中图分类号:R734.2文献标识码:A
Effects of Overexpression of NLRP3on Biological Behavior of Different
CelLinesofNon-smalCelLungCancer
DU Weihua1，,WANG Changyuan3,XIN Fangjie4,SONG Wen5,
YANG Zhencui2,ZHAO Peng4,ZONG Jinbao6
（1.Medical Department of Qingdao University,Qingdao266101,China；
2.Department of Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao266500,China；
3.Department of Dermatology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao266011,China；
4.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao266500,China；
5.Digestive Endoscopy Center,the Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao266071,China；
6.Department of Clinical Laboratory,Qingdao Hospital of Traditional Chinese Medicine and the Affiliated Qingdao
Hiser Hospital of Qingdao University,Qingdao266034,China）
Abstract：Objective To explorethe effectoflentivirus-mediated overexpression of NLRP3onthe proliferation,migration,invasionandapoptosisofnon-sma l ce l lungcancer（NSCLC）A49and NCI-H460cell lines,and to compare the biological behavior of the two cell lines,so to addres s the po s ibilityofNLRP3asanewtargetorpotentialregulatorforthedrugdevelopment Methods NLRP3
DOI：10.11748//bjIny.issn.l006-1703.2021.03.024
收稿日期:2020-11-30；修回日期:2021-02-20
基金项目：中国博士后科学基金第60批面上项目（编号:2016M600523.）；青岛市博士后应用研究项目（编号=2016050.）
作者简介：杜卫华（1990—），硕士.研究方向：肿瘤免疫学.
通讯作者：宗金宝（1978—），博士，硕士生导师，主任技师.检验科及中心实验室负责人.研究方向：肿瘤免疫学.
overexpre s ionlentivirusvectorwasdesignedandconstructed Human NSCLC A49and NCI-H460 ce l lineswereinfectedwithoverexpressionlentivirusvectorornegativecontrollentivirusvector,and NLRP3overexpre s ionce l sandnegativecontrolce l swereobtainedrespectively Theproliferation, migration,invasion and apoptosis of the two groups were detected by CCK-8method,cell scratch test,Transwe l invasiontestandflowcytometry Resuts Theoverexpre s ionofNLRP3couldpromote the proliferation of A549cells,inhibit the proliferation of NCI-H460cells,enhance the migration and invasion of A549cells,and inhibit the early apoptosis of A549cells.The overexpression of NLRP3had no significant effect on the migration,invasion and apoptosis of NCI-H460ce l s. Conclusion Overexpression of NLRP3can enhance the proliferation,migration and invasion of A549 ce l sandinhb
tstheearlyapoptoss,whleitcanalsoinhbttheprolferatonof NCI-H460ce l s. Therefore,NLRP3may serve as a new target for the development of NSCLC therapeut c drugs or potentalregulator.
Key words:NLRP3；Overexpression；NSCLC；Proliferation；Migration；Invasion；Apoptosis
肺癌是世界范围内最常见且死亡率最高的癌症[1].非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌种类的大多数，主要包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌.肺癌的传统方案主要有手术、放疗和/或化疗，但其不良反应不可小视.近年来肺癌的分子靶向及免疫取得了极大进展并不断应用于临床，有效提高了肺癌患者的生存率和生活质量，而患者确诊后5年生存率仍低于17%⑵.肺癌具有转移早、预后差的特征，患者被确诊时大多已到了晚期，失去了最佳时机.因此探索新的靶点用以肺癌的有效至关重要.
有研究发现，炎症在肿瘤的发生、发展中起到重要的作用.炎性小体作为天然免疫诱导的机体防御炎症的一员，在癌症中的双重作用即促进或抑制癌症的进展越来越得到认可⑷.炎性小体是通过各种病原微生物感染和/或机体的生理性应激而激活的高分子量蛋白质复合物⑷.NLRP3炎性小体与其他炎性小体不同的是多种刺激物可将其激活，如细胞内K+外流、细胞内Ca2+浓度的改变、细菌或病毒的感染、溶酶体损伤、活性氧形式等.NLRP3炎性小体与多种疾病的发展高度相关：多种癌症如肺癌、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤等⑹.炎症性疾病如类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病；代谢性疾病如
2型糖尿病；神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病；心血管疾病如缺血及非缺血性心脏病等[6].因此，NLRP3炎性小体是目前最为关注的炎性小体，由核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族成员NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 (Caspase-1)组成的大分子多蛋白复合体⑺。NLRP3炎性小体一旦被激活便触发前Caspase-1蛋白水解为有活性的Caspase-1(pl0或p20)，活性形式的Caspase-1将切割前IL-邛和前II-18使其形成成熟的促炎细胞因子II-邛和II-18，从而对细胞凋亡起诱导作用8.
值的关注的是，某些研究报道NLRP3可独立于炎症小体途径而发挥作用9.如NLRP3的过表达和组成性激活参与晚期黑素瘤的进展[10].另有研究皈表明，下调NLRP3表达，抑制Caspase-1的活性、阻断II-邛和/或II-18信号转导通路等不同途径使NLRP3炎症小体的激活受到抑制，可减弱肺癌A549细胞的增殖和迁移能力.然而,NLRP3过表达对肺癌发生发展的影响尚不清楚.在文献综述的基础上，本实验构建了NSCLC A549、NCI-H460细胞的NLRP3过表达模型，旨在探讨NLRP3过表达对NSCLC A549、NCI-H460细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，为开发新的肺癌药物靶标或潜在调节因子提供理论依据.
材料和方法
1细胞及病毒载体的获取
人肺泡上皮腺癌细胞系和大细胞肺癌细胞系(A549、NCI-H460)均购自中国科学院细胞库(中国，上海).NLRP3过表达慢病毒载体(pLent-CMV-NLRP3-3FLAG-PGK-Puro)及阴性对照慢病毒载体(pLent-CMV-3FLAG-PGK-Puro)购自和元生物技术(上海)股份有限公司.
2实验方法
2.1 细胞培养A549、NCIH460细胞分别用含10%胎牛血清(FBS)的F12K培养基(Gibco)和RPMI-1640培养基(Gibco)，置于37°C,C()2浓度为5%的培养箱中培养。
2.2慢病毒感染A549、NCIH460细胞两种细胞均以浓度为5X104个/孔接种到24孔板中。用Lipofectamine3000(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Inc.2按照制造商说明将NLRP3过表达慢病毒载体(p Lent.i-CMV-NLRP3-3FLAG-PGK-Puro)及阴性对照慢病毒载体(pLenti-CMV-3FLAG-PGK-Puro)分别感染A549和NCIH460细胞。每孔加人反转录病毒介导的基因转导增强剂聚凝胺(1mg/mL)以提高感染效率。
2.3Western blot.检测慢病毒在A549、NCI H460细胞中的表达情况用RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂(Beyotime Institute of Biotechnology)分别从两种细胞的O/E组提取总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology)测定总蛋白浓度。取等量的两种蛋白质(20”g)在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后转移至PVDF膜上。在室温条件下用5%脱脂牛奶孵育1h，
用FLAG (Sigma-Aldrich)、GAPDH(Bioworld Technology, Inc.)的特异性抗体检测蛋白质，4C孵育过夜。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(Beyotime Institute of Biotechnology)室温孵育1h。ECL发光液(Thermo Fisher Scientific,Inc.2检测HRP在免疫印迹上的表达，显影仪(AlphaView,SA)显影。
2.4细胞增殖实验用细胞计数试剂盒8 (Obio Technology,Shanghai,China)检测细胞增殖情况。将A549、NCIH460的O/E组和CON组细胞分别以2X103个/孔接种于96孔板中，每个样品设6个复孔。分别在0、24、48、72、96h加10“L CCK-8试剂于孔中,37C,5%CO培养箱中培养2h，酶标仪(Spark10M,TECAN)检测450nm处OD值。
2.5细胞迁移分析采用划痕实验检测细胞迁移情况。将A549、NCIH460的O/E组和CON 组细胞分别铺于6孔板中，待细胞完全融合形成单层，用无菌2000.移液管尖端划线，确保划线处无细胞残留，分别在0、6、24h于倒置显微镜(DMi8, Leica)下拍照。实验重复3次。细胞迁移率(％)= (初始划痕宽度值-xh后划痕宽度值)/初始划痕宽度值x100%。
2.6细胞侵袭实验T r answelKCorning)侵袭实验检测细胞的侵袭能力。取2.5x104个A549O/E 组和CON组细胞分别悬浮于200“L无血清F-12K 培养基(Gibco)中，取5x104个NCIH460O/E组和CON组细胞分别悬浮于200“L无血清RPMI-1640培养基(Gibco)中，分别接种于上室，两种类型的细胞下室分别加入500“L含10%胎牛血清(FBS)的F-12K培养基(Gibco)和RPMI-1640培养基(Gibco)。培养24h后取出小室，
用4%多聚甲醛(Solarbi。)固定下室中的细胞，结晶紫染液(Beyotime)染，计数侵袭细胞数，显微镜下拍照。实验重复3次。
2.7细胞凋亡检测流式细胞技术定量检测细胞凋亡情况。扌巴A549、NCIH460的O/E组和CON组分别用不含EDTA的胰酶消化制成单细胞悬液，离心后收集细胞。结合缓冲液悬浮细胞，用Annexin V-APC/7-AAD(Keygen Biotech)染，同时以单独染Annexin V-APC和7-AAD的各组细胞作为对照，室温、避光反应15min,1h内用流式细胞仪(FACSCalibur,BD)进行检测,FlowJo软件10.6 (FlowJo LLC)软件分析结果。实验重复3次。
3统计学处理
采用 SPSS19.0和GraphPad Prism  5.01软件进行统计学分析，计量资料以均数士标准差表示, Shapiro-Wilk法进行正态性检验,Levene法进行方差齐性检验，两组之间的比较采用t检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。
结果
1NLRP3在A549、NCI-H460细胞中均过表达
Western blot.检测NLRP3-F1AG在A549、NCI H460细胞中的表达。如图1A和1B所示，两种细胞的NL
RP3O/E组FLAG表达量均明显高于CON组(P<0.01)，说明NLRP3在 A549、NCIH460细胞中过表达成功。
1.00.8
0.60.40.2
0.0
CON  NLRP3 O/E
O V 」H  J O
IQA-UOISSaldxQ
05
A
FLAG
GAPDH
B
CON  NLRP3 O/E
O V 」H  J O
IQA-UOISSaldxQ
05
FLAG
GAPDH 注:A  A 549 NLRP 3 O/E  组明显表达 FLAGGB  NCI-H460 NLRP 3 O/E  组明显表达 FLAG.
与对照组相比,* P <0.21
图1检测NLRP 3过表达慢病毒在肺癌A 549、NC-H460细胞中的表达情况
2 NLRP3过表达对A549细胞的增殖起促进
作用，对NCI-H460细胞的增殖有抑制作用
细胞计数试剂盒8 （ Obio  Technology, Shanghai,China ）检测细胞增殖情况.如图2A 、2B
所示,h 时A 549细胞O/E 组和CON 组的吸光度 无明显差异,4、48、72、96 h 时,O/E 组吸光度值均
明显咼于CON 组（均P <0.01）. 0 h 时NCIH460 细胞O/E 组和CON 组的吸光度无明显差异，24、
48.2.6 h 时，O/E 组吸光度值均明显低于CON  组（均P <0.01）.以上结果说明NLRP 3过表达促 进A 549细胞的增殖，抑制NCI-H460细胞的增殖.
注：(E u o s
寸
)a 。
A
NLRP 3过表达增强Oh
A 549图2细胞的增殖能力；
B  NLRP 3过表达抑制NLRP 3过表达对肺癌A549.NCI-(E u o s
寸
)a 。
NCI-H460细胞的增殖能力.与对照组相比,* P <0.01
H460细胞增殖能力的影响
3 NLRP3过表达可增强A549细胞的迁移能
力，对NCI-H460细胞的迁移能力无明显 影响
用划痕实验检测细胞迁移情况.如图3A 所示,
6 h 时A 549细胞的O/E 组和CON 组迁移率差异
无统计学意义（P  =0.884）,4 h 时O/E 组细胞迁移
率咼于CON 组（P  =0.02）.如图3B 所示，NCI
H460 O/E  组和 CON  组在 6 h （P  = 0.797 ）、24 h  （P  = 0.885）迁移率差异均无统计学意义.因此
NLRP 3过表达可对A 549细胞的迁移能力有促进作
用，对NCIH460细胞的迁移能力无明显影响
.
(抿
-3.! U O T a J -U J
=39
241
6h -r-oh
10
86
420
6h  24h
Oh
NLRP3 O/E
(抿
-3.! U O T a J -U J
=39
Oh  6h  24h
proliferationNLRP3 O/E
CON
Oh 6h 24h
B
注：A  NLRP 3过表达增强A 549细胞的迁移能力；B  NLRP 3过表达对NCI-H460细胞迁移能力无明显影响.与对照组相比图3 NLRP 3过表达对肺癌A549.NCI-H460细胞迁移能力的影响
, P  005
4 NLRP3过表达对A549细胞的侵袭能力有
促进作用，对NCI-H460细胞的侵袭能力无 明显影响
TranswelKCorning ）侵袭实验检测细胞的侵袭 能力.如图4A 所示，结晶紫染24 h 后统计分析 进入小室的细胞数量可以发现，A549细胞O/E 组
侵袭细胞数明显咼于CON 组侵袭细胞数（P  <
0.01），即NLRP 3过表达可增强A 549细胞的侵袭能 力.如图4B 所示,NCI  H460细胞的O/E 组与 CON 组侵袭细胞数差异无统计学意义（P  = 0.09）,
以上结果说明NLRP 3过表达对NCIH460细胞的 侵袭能力无明显影响.
5=30
P3PEA
.S J0
JQquJnN
NLRP3 O/E
5=30
P3PEA
.S J0
JQquInN
CON
注:A  NLRP 3过表达增强A 549细胞的侵袭能力；B  NLRP 3过表达对NCI-H460细胞侵袭能力无明显影响.与对照组相比,* P <0.21
图4 NLRP 3过表达对肺癌A549.NCI-H460细胞侵袭能力的影响
5 NLRP3过表达对A549细胞的早期凋亡有抑
制作用，对晚期凋亡无明显影响；NLRP3过表
达对NCI-H460细胞的凋亡无明显影响流式细胞技术定量检测细胞凋亡情况.如图
5A 所示,A 549 O/E 组细胞早期凋亡率明显低于
CON 组（P <0.01），晚期凋亡率两组的差异无统计
学意义（P =0.38）.如图 5B  所示,NCI-H460 O/E  组和CON 组细胞的早期凋亡率（P  = 0.588）和晚期
凋亡率（P  =0.176）差异均无统计学意义.以上结果 表明NLRP 3过表达抑制A 549细胞的早期凋亡，对 晚期凋亡无明显影响；其过表达对NCIH460细胞
的凋亡无明显影响
.