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农药学学报 2021, 23(2): 348-356
reactive diluentChinese  Journal  of P esticide  Science •研究论文• doi: 10.16801/j.issn. 1008-7303.2021.0020
己哩醇及其对映体对人体乳腺癌细胞的
选择毒性及氧化损伤研究
兰阳「，孙大利X庞俊晓'，孙晓红T
(1.贵州医科大学公共卫生学院/环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳550025； 2.贵州医科大学
食品科学学院，贵阳550025； 3.贵阳学院食品与制药工程学院，贵阳550005)
摘要：在对映体水平上研究己哇醇对人体乳腺癌细胞(MCF-7)的选择毒性及氧化损伤。以
MCF-7细胞作为受试对象，采用Cell  Counting  Kit-8 (CCK-8)试剂盒测定经己"坐醇对映体处理
后的细胞毒性；采用氧化损伤相关试剂盒测定经己哇醇对映体处理后，细胞内乳酸脱氢酶
(lactate  dehydrogenase, LDH)释放量、活性氧(reactive  oxygen  species, ROS)产生量、超氧化物
歧化酶(superoxide  dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性。结果表明：在10 ~ 160 mg/L
范围内随着染毒质量浓度的增加，经过(+)-和rac-己哇醇处理后的MCF-7细胞活性分别 从 85.24%、87.11% 和 103.87% 降低至 4.07%、5.11% 和 5.24%。其中，(-)-己哇醇对 MCF-7 细
胞活性的抑制率最高，其次是(+)-和rac-己哇醇。氧化损伤检测结果显示，MCF-7细胞经20、
40和80 mg/L 的己11 坐醇对映体暴露后，细胞内LDH 释放量和CAT 酶活性随着己哇醇质量浓度
的增加而逐渐增加，而ROS 产生量和SOD 酶活性则随着己11 坐醇质量浓度的增加呈现出先上升 后下降的趋势。与细胞毒性结果相似，经3种形式的己哇醇处理后，(-)-己哇醇诱导的细胞氧 化损伤程度最高，其次是(+)-和rac-己"坐醇。本研究结果表明，己哇醇及其对映体在MCF-7细
胞内的毒性和氧化损伤程度大小顺序为(-)-己哇醇〉什)-己"坐醇〉rac-己哇醇。研究结果可为探 明己哇醇的细胞毒性机制和开展食品安全风险评估提供依据。
关键词：己哇醇；对映体；人体乳腺癌细胞；细胞毒性；氧化损伤
中图分类号：S482.2： TQ450.26
文献标志码：A  文章编号：1008-7303(2021)02-0348-09
Study  on  the  enantioselectivity  cytotoxicity  and  oxidative  damage  of
hexaconazole  on  MCF-7 cells
LAN  Yang 1, SUN  Dali", PANG  Junxiao 3, SUN  Xiaohong*'2
(1. College  of P ublic  Health/Key  Laboratory  of E nvironmental  Pollution  Monitoring  and  Disease  of M inistry  of E ducation. Guizhou
Medical  University', Guiyang  550025, China; 2. College  of F ood  Science, Guizhou  Medical  University, Guiyang  550025,
China; 3. Food  and  Pharmaceutical  Engineering  Institute, Guiyang  Uni v ers t iy, Guiyang  550005, China)
Abstract: In  this  work, the  enantiosclective  toxicity  and  oxidative  stress  of  hexaconazole  on  MCF-7
cells  were  investigated.. The  activities  of  MCF ・7 cells  were  tested  after  the  exposure  of  hexaconazole  enantiomers  by  CCK-8 kit. The  changes  of  LDH  release, ROS  production, SOD  and  CAT  enzyme
收稿日期：2020-07-03；录用日期：2020-10-26.
基金项目：贵州省科学技术厅项目(黔科合平台人才［2017］5718)；贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY 字［2018J203).
作者简介：兰阳，女，讲师，研究方向为营养与食品卫生学，E-mail ： ********************；孙晓红，通信作者(Author  for
correspondence)，女，教授，研究方向为营养与食品卫生学，E-mail ： *****************
No.2兰阳等：己畔醇及其对映体对人体乳腺癌细胞的选择毒性及氧化损伤研究349
activities were measured by oxidative damage kits.Results showed that cell activities decreased from
85.24%,87.11%and103.87%to4.07%,5.11%and5.24%,respectively,after the treatment of(-)-,(+)-
and rac・hexaconazole in the range of10・160mg/L.(-)-Hexaconazole exhibited the highest inhibitory rate on MCF-7cell activ让y,followed by(+)-and rac・hcxaconazolc.Oxidative damage results showed that after hexaconazole exposure at the concentrations of20,40and80mg/L,the intracellular LDH release and CAT enzyme activity were gradually increased with the increase of the concentration,while ROS production and SOD activity were increased first and then decreased with the in c rease of the concentration.Similar to cytotoxicity results,(-)-hexaconazole induced the highest cell oxidative damage.In conclusion,the toxicity order to MCF-7cells was(-)-hexaconazole>(+)・hexaconazole> rac-hexaconazole.The results of this study provided a basis for further exploring the cytotoxicity mechanism of hexaconazole and the food safety risk assessment.
Keywords:hexaconazole;enantiomer;MCF-7cells;cytotoxicity;oxidative damage
0引言
己哩醇(hexaconazole)属三呼类高效杀菌剂，因其良好的杀菌效果被广泛应用于水稻纹枯病、苹果白粉病和小麦锈病等病害的防治但己哇醇较难降解，容易通过农田进入环境，进而对人体健康造成一定程度的危害。己呼醇具有一个手性中心，存在两个对映异构体，属于手性农药。农药对映异构体(以下简称对映体)在环境中的迁移、转化、降解以及在生物体内的吸收、转移、代谢、分布和排泄过程中均可表现出
不同的行为，从而导致其具有不同的环境行为、生物活性及毒性作用例如，7?-丙漠磷对小鼠的毒性大于S-丙漠磷，但对乙酰胆碱酯酶活性的影响则相反同。因此，只有在对映体水平上研究其所引起的环境行为和毒性才能更全面地评估手性农药对生态环境及人类健康所带来的风险。闫冬艳⑹研究了毗＜1菌胺和丙硫菌瞠两种新型手性农药对HepG2细胞的对映体选择性毒性，得出细胞毒性机制为毗嗟菌胺峰1＞毗口塞菌胺峰2＞毗嚎菌胺外消旋体以及丙硫菌哇峰2＞丙硫菌噪外消旋体〉丙硫菌瞠峰1的研究结果。杨桂玲等⑺明确了8种农药多残留组合对HepG2人肝癌细胞增殖的抑制效应，在所测定的22个农药组合中，大多数组合的剂量-效应关系基本符合传统的毒理学剂量-效应曲线关系，证实了农药多残留在较低的剂量下即有可能产生较强的细胞毒性作用。
相关研究表明，己呼醇对映体在不同生物体内所引起的毒性存在差异性，甚至毒性作用完全相反同。有关己哇醇在兔子何、黄瓜M、大型潘及斑马鱼z等动植物体内的立体选择性研究已有报道，但其对人体细胞的选择性毒性研究尚未见报道。己哇醇已被欧盟(EU)和世界自然基金组织(WWF)列为具有生殖和内分泌干扰毒性的化合物之一冋。人体乳腺癌细胞MCF-7具有容易获得、在实验室条件下容易培养繁殖、培养成本低、对已輕醇毒性比较敏感以及发育成熟期短等优势。农药对生物体或细胞造成的毒性损伤通常与ROS的形成有关“网，一旦接触到污染物，生物或细胞就会建立防御系统，之后通过酶和非酶抗氧化剂来消除损害。活性氧(ROS)的形成可影响超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性，从而诱导氧化损伤［,5-,61o因此，氧化应激被广泛用于研究污染物对生物体或细胞的毒性［,7-|91»
为了明确己哇醇对映体的选择性毒性及其作用机制，本研究以MCF-7作为体外模型，从对映体水平上研究了细胞活力及氧化应激性存在的差异，旨在对映体层面开展己哇醇的研究，并深入研究对映体的选择性毒性及其作用机制，以便为由己哇醇引起的环境行为和毒性效应做出更全面的风险评估，为筛选高效且生物低毒的对映体单体提供科学依据。
1材料与方法
1.1供试材料
人体乳腺癌MCF-7细胞由贵州医科大学药学院提供。rac-己哇醇(外消旋体)标准品纯度为99.0%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司(Augsberg，德国)。(+)-己哇醇和(-)-己哇醇纯光学对映体标准品纯度为99.0%，购自上海勤路生物技术有限公
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司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自DOJINDO公司（日本熊本）。乳酸脱氢酶（LDH）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）高糖培养基、胰酶消化液和青霉素-链霉素购自加拿大Wisent Biotechnology公司。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物科技有限公司。
1.2主要仪器
BPN—50CH二氧化碳培养箱（上海一恒，中国）；超净工作台（苏州金净，中国）；SYNERGY H4型荧光多功能酶标仪（Bio TeK，美国）；CKX31倒置生物显微镜（Olympus，日本）；1510型酶标仪（Thermo Fisher，美国）；液氮储存罐（东亚YDS SOB）；AUW120D型分析天平（Shimadzu，日本）；移液（Eppendorf，德国）；TG20K高速冷冻离心机（上海舜制仪器制造有限公司，中国）。
1.3试验方法
1.3.1细胞培养及样品前处理细胞培养及样品前处理参照孙大利报道的方法™。细胞培养液为含10%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM培养液，培养液每2d更换1次。细胞置于37°C、含5%CO2的培养箱中培养。为了测定己哇醇对映体对MCF-7细胞的毒性及氧化损伤情况，将浓度约为5x104cells/mL的细胞悬浮液分别加入24孔板或96孔板中，置于培养箱中培养24h，用含不同质量浓度rac-、（+）-和（-）-己呼醇的DMEM培养液替换原培养液，进行染毒试验。
1.3.2细胞活性测定取上述含有MCF-7细胞的悬浮液（浓度约为5x io4cells/mL）100gL，加入96孔板中培养24h；移去细胞培养液，用PBS清洗3次。分别加入110gL含有10、20、40、80和160mg/L rac-、（+）-和（-）-己哩醇的DMEM培养液。同时设空白组和对照组。空白组为100gL DEME培养液（无细胞）；对照组为100gL DMEM培养液和细胞。每浓度或空白重复3次。将加样后的96孔板置于培养箱中
染毒24ho参照试剂盒说明书，向每孔中加入10g L CCK-8溶液，置于培养箱中孵育lh，使得CCK-8还原为甲瓒。采用酶标仪测定波长450nm下的吸光度。
1.3.3细胞氧化损伤的测定
1.3.3.1LDH释放量的测定将MCF-7细胞（浓度约为5x io4cells/mL）在24孔板中培养24h，移去细胞培养液，分别加入含有20、40和80mg/L rac-、（+）-和（-）-己醴醇的DMEM培养液，于培养箱中暴露24h。每浓度重复3次。根据试剂盒中提供的检测方法（表1），采用酶标仪测定波长440nm 下的荧光吸收值，计算细胞释放的LDH含量。
表1各处理组乳酸盐脱氢酶（LDH）活性测定反应体系
Table1The reaction system of LDH activity measurement in each treatment group®L)
试剂Reagent
空白组
Blank group
标准组测定组对照组
Standard group Experiment group Control group
双蒸水Double distilled water2555
丙酮酸标准液Pyruvic acid 待测样本Sample
基质缓冲液Buffer
20
2020 25252525
辅酶I应用液Coenzyme I—一5—混合均匀，置于37°C水浴锅中水浴15min。Mix and place in37°C with water bath for15min.
2,4•二硝基苯耕2,4-dinitrophenyIhydrazine25252525混合均匀，置于37°C水浴锅中水浴15min。Mix and place in37°C with water bath for15min.
0.4mol/L NaOH250250250250
1.3.3.2ROS含量测定将细胞（浓度约为5x104 cells/mL）在96孔板中培养24h，移去细胞培养液，分别
加入含有20、40和80mg/L rac->（+）-和（-）-己哇醇的DMEM培养液，于培养箱中暴露24ho除去染毒培养液，用PBS洗涤细胞3次，同时设空白对照组及阳性对照组。空白对照组以细胞培养液代替染毒培养液。活性氧阳性对照（ROSup）组以稀释后的阳性对照液（无酚红DMEM以体积比1:1000稀释）代替细胞培养液。DCF-DA溶液用无酚红DMEM以体积比为1:1000的比例稀释，配成工作液。向每孔中加入100nL稀释后的DCFH-DA工作液，在37°C 培养箱中孵育30min后弃去上层液体，用无酚红DMEM洗涤细胞3次，除去未进入细胞的DCFH-
No.2兰阳等：己醴醇及其对映体对人体乳腺癌细胞的选择毒性及氧化损伤研究351
DAo最后，向每孔加入100nL PBSo每浓度处理重复3次。在酶标仪下，以485nm为激发波长、525nm为发射波长，测定荧光值。
1.3.3.3SOD及CAT酶活性测定为了检测细胞中SOD和CAT酶活性，向24孔细胞培养板中加入2mL浓度为5x104cells/mL的细胞悬浮液。培养24h后，分别用含有20、40和80mg/L rac-、(+)-和(-)-己哇醇的DMEM培养液替换原细胞培养液，同时设置空白对照组。每处理重复3次。染毒24h后，弃去上层培养液，用PBS洗涤细胞3次。每孔加入300pL细胞裂解液，裂解30min 后用微量移液器吸出，待测。按照试剂盒中的检测方法(表2和表3)。分别向5mL离心管中依次加入表中试剂，每浓度重复3次，混合均匀后，室温静置10mine分别在550nm及405nm的荧光波长下测定SOD酶及CAT酶活性。
表2各处理组细胞内SOD活性测定反应体系
Table2The reaction system of SOD activity measurement in each treatment group(2)试剂对照孔空白孔测定孔测定空白孔
Reagent Control Blank Measured Measured blank
待测样本Sample——2020
蒸憾水Distilled water2020——
酶工作液Enzyme20—20—
酶稀释液Enzyme diluent—20—20
底物应用液Substrate200200200200混匀，37°C孵育20min,450nm处酶标仪读数。Mix,incubate at37°C for20min,and read at450nm.
表3各处理组细胞内过氧化氢酶(CAT)活性测定反应体系
Table3The reaction system of CAT activity measurement in each treatment group(mL)试剂对照组测定
组
Reagent Control group Measured group
待测样本Sample—0.05
试剂一(37°C预热)Reagent1(37°C preheating)  1.0  1.0
试剂二(37°C预热)Reagent2(37°C preheating)0」0.1上述试剂混合均匀，置于37°C水浴锅中反应1min。The mixture was mixed and placed in z i37°C water bath for1min.
试剂三应用液Reagent3  1.0  1.0
试剂四Reagent30.10.1
双蒸水Double distilled water0.05—
1.4数据处理
所有处理均设置3个平行，数据以Mean±SD表示。全部数据利用软件SPSS17.0进行统计分析，各组间的显著性检验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步进行组间两两比较，若方差齐时，采用St
udent-Newman-Keuls检验；若方差不齐，则采用Tamhane's检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。*表示单个对映体或者外消旋体与对照组之间存在显著性差异(P<0.05)o 相同字母代表对映体之间或者对映体与外消旋体之间不存在显著性差异，不同字母则代表二者之间存在显著性差异(P<0.05)o
2结果与分析
2.1己瞠醇及其对映体处理对MCF-7细胞形态的影响
不同浓度的己哇醇暴露24h后，3种结构形式的己哇醇对MCF-7细胞形态均有不同程度的破坏。随着暴露浓度增加，细胞形态损伤越发严重，可见细胞形态损伤程度与已哇醇暴露浓度呈正相关。
图1为空白对照及20、40和80mg/L的rac-己瞠醇处理后MCF-7细胞形态变化情况。空白对照组的细胞贴壁生长良好，细胞形态完整，几乎覆盖整个培养皿(图1A)；当培养液中rac-己哇醇的质量浓度为20mg/L时，与空白对照组相比，细胞状态良好，但体积有一定增大；当其质量浓度增加到40mg/L时，细胞开始出现损伤，体积增大，细胞数量开始减少，死亡细胞失去黏性漂浮在培养液中，细胞形态不再是正常的菱形；当其质量浓度增加到80mg/L时，细胞受到损伤，很难观察到状态良好的细胞，大量的细胞漂浮于培养液中，说明在此浓度下，rac-己哇醇对MCF-7细胞造成了损伤。
图2为空白对照、20、40和80mg/L的(+)-
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农药学学报
Vol. 23
A.空白，
B. 20 mg/L  己呼醇，
C. 40 mg/L  己哇醇，
D. 80 mg/L  己哇醇(x  40)。
A. Blank  group,
B. 20 mg/L  hexaconazole,
C. 40 mg/L  hexaconazole,
D. 80 mg/L  hexaconazole  (x  40).
图1 Rac ■己瞠醇对MCF-7细胞形态的影响
Fig. 1 Effects  of  Rac-hexaconazole  on  MCF-7 cells  shape
己哇醇处理后MCF-7细胞形态的变化。不含己呼 醇的细胞贴壁生长良好，几乎覆盖了整个培养皿; 当什）-己瞠醇质量浓度为20 mg/L 时，少量细胞开
始增大，镜下可见少量亮斑，说明在此浓度下，
（+）-己醴醇对细胞形态有一定影响；当（+）-己哇醇 增加到40 mg/L 时，细胞黏性减弱，半数细胞漂
浮在培养液中，细胞形态不能维持正常的菱形；
当（+）-己哇醇质量浓度增加到80 mg/L 时，细胞开 始溶解，镜下观察不到贴壁的正常细胞，几乎全 部漂浮于培养液中，说明在此浓度下（+）-己呼醇
对MCF-7细胞造成了损伤。
A.空白，
B. 20 mg/L  己哇醇，
C. 40 mg/L  己哇醇，
D. 80 mg/L  己呼醇(><40)。
A. Blank  group,
B. 20 mg/L  hexaconazole,
C. 40 mg/L  hexaconazole,
D. 80 mg/L  hexaconazole  (x  40).
图2 (+)■己輕醇对MCF-7细胞形态的影响
Fig. 2 Effects  of  (+)-hexaconazole  on  MCF-7 cells  shape
图3为空白对照组及经20、40、80 mg/L 的 （_）_己陞醇处理后MCF-7细胞形态的变化。空白
组的细胞贴壁生长良好，几乎覆盖了整个培养 皿；当（-）-己醴醇的质量浓度为20 mg/L 时，细胞
体积开始增大，镜下可见少量细胞浮漂于培养液 中；当（-）-己哇醇增加到40mg/L 时，大量细胞形
态被改变，细胞数量大幅减少，半数细胞漂浮在
培养液中；当（-）-己瞠醇增加到80 mg/L 时，细胞 开始溶解，细胞数量急剧减少，几乎全部漂浮于
培养液中，说明在此质量浓度下，（-）-己哩醇对
MCF-7细胞造成了较大的损伤。
A.空白，
B. 20 mg/L  己呼醇，
C. 40 mg/L  己哇醇，
D. 80 mg/L  己哇醇(><40)。
A. Blank  group.
B. 20 mg/L  hexaconazole,
C. 40 mg/L  hexaconazole,
D. 80 mg/L  hexaconazole  (x  40).
图3 (-)-B®醇对MCF-7细胞形态的影响
Fig. 3 Effects  of  (-)-hexaconazole  on  MCF-7 cells
shape