紫草素通过促进ROS的产生诱导人非小细胞性肺癌A549细胞凋亡的机制
马建文;冯伟;张立平;李伟
【摘 要】目的 研究紫草素对人非小细胞性肺癌A549细胞的抗肿瘤作用,并探讨其可能的机制.方法 不同浓度紫草素处理A549细胞和人正常肺MRC-5细胞,四氮唑盐还原(MTT)法检测细胞的活性;流式细胞术结合PI-FITC双染测定细胞凋亡;2'7'-二氯双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针测定活性氧(reactive oxygen species,ROS);Western blot法测定caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达.结果 紫草素对A549细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈现出时间和剂量依赖性(P＜0.05,P＜0.01);当剂量≤l0μmol/L时,其对MRC-5细胞的增殖没有明显的影响(P＞0.05).不同浓度紫草素处理24h后,A549细胞的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著增加(P＜0.05或P＜0.01),caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白被诱导活化,caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)预处理则明显降低A549细胞的凋亡率(P＜0.01),并抑制以上3种蛋白的活化.另外,紫草素处理可引起A549细胞ROS的产生,且呈现出一定的剂量依赖性.ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和L-谷胱甘肽(GSH)预处理可使A549细胞的凋亡率下降(P＜0.01).同时,紫草素处理可明显下调抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL的表达(P＜0.01),NAC和GSH预处理亦能上调Bcl-2和Bcl-xL的表达(P＜0.
01).结论 紫草素可明显抑制肺癌A549细胞的增殖,其作用机制与诱导A549细胞产生大量的ROS,抑制抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL表达,进而激活caspase依赖的凋亡途径有关.
【期刊名称】reactive oxygen species (ros)《医学研究杂志》
【年(卷),期】2018(047)012
【总页数】7页(P103-109)
【关键词】紫草素;A549细胞;ROS;细胞凋亡;Caspase
【作 者】马建文;冯伟;张立平;李伟
【作者单位】830001乌鲁木齐,新疆医科大学附属中医医院药学部;830001 乌鲁木齐市妇幼保健医院药剂科;830001 乌鲁木齐,新疆医科大学附属中医医院肿瘤二科;830001乌鲁木齐,新疆医科大学附属中医医院药学部
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5
肺癌是病死率最高的肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)大约占所有肺癌种类的85%[1]。而晚期NSCLC患者总的生存率却很低，因而肺癌的药物显得尤为重要。传统的化疗药物主要是细胞毒性类药物，其作用机制主要是依赖于肿瘤细胞与正常细胞生长、修复、死亡动力学等之间的差异，往往缺乏特异性[2]。因此，选择性杀死肿瘤细胞而减少对正常组织的损伤作用是肿瘤化疗的新挑战。
紫草素(shikonin)是一种由草本植物紫草根部提取来的萘醌化合物，研究发现，其具有良好的抗炎和抗菌活性，故可以烧伤，皮肤病和喉咙疼痛等[3，4]。最近已经证明，紫草素具有显著的抗肿瘤活性，如诱导肝癌细胞凋亡、抑制黑素瘤的增殖、杀死白血病细胞等[5，6]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)和肿瘤生物学密切相关，在许多类型肿瘤细胞中，氧化应激明显增强，一方面肿瘤的发生、生长和转移过程需要氧化应激的介导；另一方面增加基础氧化应激使得肿瘤更容易受到化疗药物的影响[7]。细胞内ROS的过量累积会造成蛋白质、酶或生物膜的损伤，最终激活凋亡信号通路[8]。所以，通过破坏肿瘤细胞的抗氧化体系或者诱导ROS的产生可以使其处于高水平的氧化应激之中，从而抑制细胞增殖或引起细胞死亡，达到肿瘤的目的，其成为了一种选择性杀死癌细胞的策略。本研究系统探讨紫草素对A549细胞增殖和凋亡的影响以及可能的作用机制，旨在为紫草素的抗癌作用及其
分子机制提供可靠的理论基础。
材料与方法
1.试剂与仪器:紫草素(美国Sigma公司)溶解在DMSO(美国Sigma公司)中。人非小细胞性肺癌A549细胞和人正常肺MRC-5细胞(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。MEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)。caspase非选择性抑制剂Z-VAD-FMK(美国MedChemExpress公司)。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和L-谷胱甘肽(GSH)(中国Beyotime公司)。小鼠抗人单克隆抗体如下：caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和GAPDH(Cell Signaling Technology，美国)；Cy3标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(二抗)(中国中山金桥生物技术公司)；PI-Annexin Ⅴ-FITC试剂盒和2′7′-二氯双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针(美国Sigma公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。
2.细胞培养和药物分组：将A549细胞和MRC-5细胞置于MEM培养液中，其培养基中含10%胎牛血清、链霉素100U/ml和青霉素100U/ml，然后在5% CO2、37℃条件下培养。待细胞铺满瓶壁70%～80%时，再以胰蛋白酶消化传代培养，取对数生长期细胞用于实验。MRC-5细胞只进行不同紫草素处理后细胞活性的检测。A549细胞分为对照组、紫草素组、Z-VAD-FM
K预处理合并紫草素组、NAC预处理合并紫草素组和GSH预处理合并紫草素组。紫草素组用不同浓度的紫草素处理。Z-VAD-FMK预处理合并紫草素组先使用20μmol/L的Z-VAD-FMK预处理2h，离心换液，然后紫草素处理24h后检测。NAC预处理合并紫草素组和GSH预处理合并紫草素组先使用1nmol/L的NAC或GSH预处理2h，离心换液，然后紫草素处理24h后检测。
3.MTT法检测细胞增殖:取A549细胞和MRC-5细胞单细胞悬液，以5×105/ml密度接种于96孔培养板，每孔100μl，每组设5个复孔。标准条件下培养48h后加入新的含紫草素的培养液，紫草素终浓度分别为5、10和20μmol/L，对照组不加药物(只含等量培养基)。分别培养0、12、24、36和48h后加入20μl 5mg/ml的MTT溶液处理，然后加入150μl的DMSO ，避光震荡10min，最后置于酶标仪在492nm波长处检测处各孔吸光值，并计算增殖抑制率。另外，不同浓度紫草素处理24h后对A549和MRC-5细胞增殖的影响采用的紫草素的浓度梯度依次是2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20μmol/L，其他实验步骤如上。抑制率(%)=(空白对照组A值-处理组A值)/空白对照组A值×100%。
4.流式细胞术检测细胞凋亡:A549细胞凋亡的检测使用PI-Annexin Ⅴ-FITC试剂盒。具体方法
简述如下：将对照组和不同浓度紫草素处理组的A549细胞用PBS洗涤两次后重悬于结合缓冲液(binding buffer)，然后加入5μl的Annexin Ⅴ-FITC染，混匀后再加入5μl的PI混匀，室温避光反应10min，最后在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。
5.ROS的测定:采用DCFH-DA荧光探针测定ROS的含量。不同浓度紫草素处理A549细胞24h以后，取对数生长期细胞收集细胞并调整细胞浓度至1～10×106/ml，加入终浓度为10μmol/L的DCFH-DA，37℃ 5% CO2培养箱中静置0.5h，每隔3～5min混匀一下，使探针和细胞充分作用。然后用温暖的PBS液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA，最后收获各组细胞通过流式细胞术测量DCF荧光强度。
6.Western blot法检测：取对数生长期A549细胞接种于培养瓶，用不同浓度紫草素处理24h，弃去培养液，加入RIPA细胞裂解液裂解30min，BCA法测定裂解液中的蛋白浓度。取30μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，TBST漂洗，将PVDF膜放入含有caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和GAPDH对应单克隆抗体一抗中(1∶1000)，4℃冰箱内孵育过夜，用TBST 漂洗，再与Cy3标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(1∶5000)室温下孵育2h，漂洗后，用Tanon 5500凝胶成像系统拍照并分析蛋白产物条带的相对光密度值。
7.统计学方法:采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Student′s t检验。每一组数值以至少3次独立实验得到，以P<0.05差异有统计学意义。
结 果
1.紫草素对A549细胞活性的抑制作用:MTT法研究紫草素对A549细胞和MRC-5增殖的影响。如图1、图2所示，不同浓度的紫草素(0、5、10和20μmol/L)处理不同的时间(0、12、24、36和48h)对A549细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈现出显著的时间和剂量依赖性(P<0.05，P<0.01)；而在剂量≤10μmol/L时其对MRC-5细胞的增殖没有明显的影响(P>0.05)。进一步研究不同浓度紫草素处理24h后对A549和MRC-5细胞增殖的影响，不同浓度紫草素处理24h后对A549细胞均有一定的增殖抑制作用，当紫草素浓度<10μmol/L时其对A549细胞的抑制率较低，当剂量≥10μmol/L时抑制率呈快速上升趋势，而对于MRC-5细胞的抑制均不明显(图3)。紫草素作用24h的半数抑制率浓度约为10μmol/L。据此后续实验选择药物处理时间为24h。
图1 紫处理时间对A549细胞增殖的影响与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
图2 紫草素不同处理时间对MRC-5细胞增殖的影响与对照组比较，*P<0.01
图3 不同浓度紫草素处理24h后对A549和MRC-5细胞增殖的影响
图4 不同浓度紫草素处理对A549细胞凋亡的影响(PI-FITC双染)
2.紫草素通过caspase依赖途径诱导A549凋亡:如图4、图5所示，不同浓度紫草素处理24h后A549细胞的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著增加，与对照组(0μmol/L紫草素)比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，呈现出一定的剂量依赖性。当A549细胞先使用20μmol/L的caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)预处理，则A549细胞的凋亡率则显著下降，与紫草素组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。进一步研究紫草素对caspase相关蛋白表达的影响，结果如图6所示，不同浓度的紫草素可明显诱导caspase-8、caspase-9和caspase-3的活化，若先使用Z-VAD-FMK预处理，则以上3种蛋白的表达显著抑制。以上实验结果说明紫草素诱导A549细胞的凋亡过程依赖于caspase途径。