实验室环境和人体表面微生物的检查
李雪彤 2009级生科3班
摘要：生物界的微生物多达几万种，可以说是无处不在。本次试验我们学习了培养基的制备及基本的灭菌方法，并接种了实验室环境（空气、桌面）和人体表面的微生物。经过一周的培养，培养皿上形成了肉眼可见的菌落，我们可以观察处在各种环境下的微生物菌落的形态特征。让我们对微生物的培养和菌落的特征有了初步的了解。同时，证明了实验室环境和人体表面存在多种多样的微生物，因此，我们应该意识到在微生物实验中“无菌操作”的重要性
关键词：实验室环境、人体表面、微生物 环境 培养 菌落
1前言：
本次实验的目的，是要学习并掌握培养基的制备原理和制作步骤，以及灭菌原理和操作过程，通过实验证明实验室和人体表面存在微生物，并观察不同微生物类的菌落其形态颜等特征。
2材料与方法：
2.1材料：
2.1.1菌种
来自于实验室环境和人体表面的菌种。
2.1.2培养基
牛肉膏蛋白胨琼脂平板。
2.2培养基的配制
2.2.1溶液及试剂
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂条、无菌水，NaOH溶液及HCl溶液
2.2.2仪器和其他用具
培养皿、三角瓶、试管、烧杯、接种环、酒精灯、记号笔、牛皮纸、灭菌棉签、试管架、废物缸等。
2.2方法与步骤:
1.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基制备（见表1）。
步骤：称量→熔化→调PH
表1：牛肉膏蛋白胨培养基实际用量（注：调PH到 7.0~7.2）
试剂 | 牛肉膏 | 蛋白胨 | NaCl | 琼脂 | 水 |
用量 | 1.5g | 5g | 2.5g | 10g | 500ml |
1.2.2 实验步骤
步 骤 | 内容 | 备注 |
1 | 高压灭菌：1.将三角瓶与装入5-10ml无菌水的2支试管塞入棉塞并用牛皮纸线绳包扎，将20个培养皿用牛皮纸包好； 2.放入灭菌锅开始灭菌。 | 121℃灭菌20min |
2 | 琼脂平板制备：1.将培养基冷却后，右手拿三角瓶，左手拿出棉塞，并快速将瓶口靠近火焰。 2.右手拿锥形瓶，左手拇指与食指将培养皿打开一道缝隙，右手将三角瓶的培养基倒入培养皿中，左手立即盖上培养皿盖。3.冷却培养皿。 | 到培养皿，接种时，三角瓶口和半开的培养皿均要保持在火焰旁，保证无杂菌进入。 |
3 | 接种：1.取棉签并用无菌水蘸湿。2.用湿棉签分别擦拭手掌，桌面，钥匙等（详见表2），并将6个培养皿置于空气中不同的时间。 | |
4 | 培养：将各组培养皿放入所需培养温度的保温箱中培养一周。 | |
5 | 观察：将培养好的菌落取出观察，并记录现象。 | |
1.2.3注意事项：
1） 在培养基的配制过程中，不必等到琼脂完全溶化再调节pH值，因为灭菌过程中温度为 121℃，且有足够长的时间可以使其溶解。另外，在加热时有水分的蒸发散失，所以要略微多加蒸馏水。
2） 琼脂融化过程中要控制好火力并不断搅拌，以免培养基沸腾溢出或焦糊。
3） 高压蒸汽灭菌时：
①不能装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
②三角烧瓶与试管口端均不应与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
③加热同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
④切断电源或关闭煤气，当压力表的压力降至0时才可打开排气阀。如果压力未降到0就打开排气阀，会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基。
4） 制备平板和接种过程中，三角瓶口和培养皿开口要在酒精灯火焰20cm范围内，防止杂菌进入。
5） 标签写在皿底，如果写在皿盖上，同时观察多个培养皿，打开盖时，易混淆。字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。字尽量小，写在皿底一边，以免影响观察结果。
表2：培养皿编号后接种情况
编号 | 1-1 | 1-2 | 1-3 | 1-4 | 1-5 | 1-6 | 2-1 | 2-2 | 2-3 | 3-1 | 3-2 | 3-3 | 3-4 | 3-5 | 3-6 |
微生物源 | 空气 | 试验台 | 洗手前 | 洗手后 | |||||||||||
5 min | 5 min | 5 min | 10 min | 10 min | 10 min | 用棉签划5cm | A | B | C | A | B | C | |||
温度 | 28 | 37 | 37 | 28 | 37 | 37 | 28 | 37 | 37 | 28 | 28 | 37 | 28 | 28 | 37 |
编号 | 4-1 | 4-2 | 4-3 | |
微生物源 | 钥匙 | 钥匙 | 钥匙 | |
温度 | 28 | 37 | 37 | |
3结果及分析
接种日期：2010年9月22日
观察日期：2010年9月29日
3.1.1实验结果
表3 菌落形态特征
菌种序号 | 样品来源 | 菌落数 | 特征描述 | 记录人 | |||||
大小 | 颜 | 干湿 | 形态 | 边缘 | 表面 | ||||
1 | 1-1 | 47 | 中等 | 白 | 干 | 不规则 | 不整齐 | 隆起 | 潘红芳 李雪彤 朴薇 刘雯雯 娄峰 |
2 | 1-2 | 32 | 中等 | 黄 | 湿 | 圆形 | 整齐 | 扁平 | |
3 | 4-1 | 32 | 小 | 橘红 | 湿 | 规则 | 整齐 | 隆起 | |
4 | 3-3 | 45 | 中等 | 白 | 湿 | 不规则 | 不整齐 | 隆起 | |
5 | 3-6 | 264 | 小 | 淡黄 | 湿 | 圆形 | 整齐 | 隆起 | |
6 | 2-2 | 52 | 大 | 白 | 干 | 不规则 | 不整齐 | 扁平 | |
7 | 1-5 | 35 | 小 | 黄 | 湿 | 圆形 | 整齐 | 隆起 | 李雪彤 |
8 | 1-4 | 60 | 小 | 淡粉红 | 湿 | 圆形 | 整齐 | 隆起 | 潘红芳 |
3.1.2实验结果分析
1、通过观察比较各个培养基上的菌落的形态及数目，置于空气中的平板中菌落种类更多样，原因：接触面大，空气流动性大，微生物种类数目较多。
2、不同的环境下接种的微生物大多形态各异，因此可以说明不同的环境中微生物的种类变化较大。
3、从形态特征看可以知道菌落的特征,来分离菌落。
根据相关组别的菌落数目观察，可以得到以下结论：
1、通过比较1-1在空气中放置5分钟后28摄氏度培养和37摄氏度培养两组的培养皿上的菌落数量以及1-5、1-4在空气中放置10分钟后28摄氏度培养和37摄氏度培养两组的培养皿上的菌落数量，28摄氏度培养皿中的菌落数多于37摄氏度的培养皿中的菌落数，由此可推断出，28摄氏度的环境可能更加适合菌落的生长
2、2、通过比较3-3洗手前培养皿和3-6洗手后培养皿上的菌落数量，洗手前的菌落数量较少，
但是菌落较大型，菌落面积大，菌落种类多，这说明洗手前我们的手上细菌较多。洗手后的培养皿中，菌落数量多，但菌落面积很小，菌落种类减少，这说明通过洗手，除去了一部分细菌，但手上仍存在一定量的细菌。
3.3.1实验结果见表5
表5 某菌种在两种菌种来源基上的数目
样品来源A | 菌落数 | 样品来源B | 菌落数 | 特征描写 |
3-2-空-10-2-37 | 1 | 3-1-手前-2-37 | 16 | 小，黄，湿，圆形，整齐，隆起 |
3-2-空-10-1-37 | 1 | 3-2-空-5-1-37 | 1 | 中等，橘红，湿，圆形，整齐，隆起 |
3.3.2实验结果分析
1、从形态特征看可以知道菌落的特征,来初步判断是否是同一种菌种。
2、通过分析3-2-空-10-2-37和3-1-手前-2-37中存在同样的菌种，可以初步推断手上的某些菌种可能来源于空气。
4课后习题
1.思考一：列举2-3类微生物，说明它们在本实验条件下（肉膏蛋白胨琼脂平板，37℃）不能生长。
因为牛肉膏蛋白胨培养基是用来培养细菌的,故不能培养真菌,例如:霉菌,酵母菌.其次实验是在37摄氏度进行，可能有些微生物不适合在此温度下培养。
2.思考二：比较各种来源的样品，哪一种菌落数和菌落类型最多？为什么？
洗手后的菌落数最多。因为在取样时，手指在培养基上按了很多下，而且菌种类型只为两种，相互间的抑制作用较小，而其他取样的培养基虽然菌种数目多，但是各种菌间的抑制作用较强，限制了菌株的生长。
菌落类型为洗手前最多。因为手接触了很多细菌或霉菌，包括空气中的，都可通过手的接触进入培养基。
3．思考三：比较洗手前后菌落数的变化，谈谈你的体会。洗手后仍有少量细菌生长，你认为是什么原因？
洗手前菌落数比洗手后菌落数少，但是菌种数目多。洗手前，多数菌落为霉菌，洗手后，大多数为小型细菌菌落，而且数量较多。猜测原因为，洗手前的平板，霉菌生长可能抑制了细菌生长，因而菌落数较少；洗手后，霉菌被除去，细菌生长不受影响，故细菌菌落较多。
4．思考四：完成本实验后，你是否已体会到我们生活在微生物的包围中？你如何体会“微生物既是我们的朋友又是我们的敌人”？
①生产方面：它们在土壤物质转化和促进植物生长有着极为重要的作用，例如根瘤菌，圆褐固氮菌都是将氮元素活化，让植物来利用的微生物。在生物工程方面，用酵母菌酿酒，用乳酸菌制酸奶，用毛霉制腐乳。还可以制造生物杀虫剂，如苏方金杆菌，日本金龟子芽胞杆菌，对人畜无害，是一种比较绿的杀虫剂。然而，有一些微生物属于动植物细菌和病毒，给农牧业生产带来危害，如烟草花叶病毒，禽流感病毒。
②生活方面：当双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌在肠道内生长、繁殖，将阻止外面的病原体入侵肠道，构筑成一个生物屏障，对人的健康有益。也有一些我们经常听说的微生物对人的健康有害，如结核杆菌会引发结核病，流行感冒病毒会引发感冒等等。
5．思考五：培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？
因为在配制培养基的过程中沾染很多微生物，如果不立即灭菌，那么培养基冷凝后接种了微生物，会影响微生物的生长，并且是培养的微生物不纯。
将灭菌后的培养基冷凝后放入37摄氏度恒温箱中培养，如果若干天后培养基上没有菌落出现，则断定培养基为无菌的。
6．思考六：在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题，为什么？
PH值应调节为7.0-7.2之间，并且在加入NaOH溶液时要注意不要加入过量，因为即使后期用HCl溶液中和调节，生成的盐类物质仍然会影响培养液的配制。
培养基配方的选定：同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。
培养基的配制记录：每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。
培养基成分的称取：培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。
培养基各成分的混合和溶化：培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应
重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。
培养基的灭菌：一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。
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