免疫组化经验总结
免疫组化经验总结
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？
1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染效果要比冰冻切片好一些。
2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。
3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。
4、从操作步骤的繁琐程度看。染过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。
5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立即固定、染效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。
如何避免荧光素提前衰退？
1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；
2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；
3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；
4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；
5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。
6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。
普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？
1、操作指南：
（1）关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯。为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。再次打开汞灯电源的间隔时间也应该在15-30分钟以上，避免反复开关。
（2）根据样品荧光素选择相应荧光组件。使用减光片对荧光强度适当调整（因为荧光强度不可调，所以只能使用各种减光片来调整观察效果）
（3）选择滤光片。常用的有绿、蓝、紫、紫外等，分别对应不同的激发光波长。
（4）放好染切片，到合适的视野。在荧光状态下观察标本，标本内的荧光会较快的衰减，所以要避免长时间的在荧光下观察，可以先在明场下调整好要观察的位置再使用荧光。
（5）需拍照先确认照相机已装好。
（6）使用结束关闭所有电源并做好使用记录。
（7）如需详细说明，请借阅说明书。
2、主要事项：
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后。
（6）标本染后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
（7）荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“—”——无或可见微弱自发荧光。“+”——仅能见明确可见的荧光。“++”——可见有明亮的荧光。“+++”——可见耀眼的荧光。
（8）所使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油。
（9）电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
如何最大限度地降低非特异性染和背景着？
产生原因：
（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染。
37度（6）荧光素不纯、标本固定不当等。
（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。
（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。
消除方法：
（1）购买高质量、高纯度的荧光素二抗。
（2）二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。
（3）调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。
（4）增加清洗次数和延长清洗时间。
（5）延长血清封闭时间。
（6）适当稀释二抗浓度至出现特异性染阳性，而非特异性染保持阴性。
一抗孵育的条件和浓度如何摸索？
1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。
2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定
阳性的组别中的动物切片。
3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向低浓度方向多摸索几个梯度，等浓度摸索好后，在大量的做不同组别的切片。
自发荧光可能原因有：
（1）游离荧光素残留在二抗中，故新买的二抗最好进行透析或层析除去游离荧光素，尽量买高质量的二抗。
（2）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之相应抗体结合。通过延长血清孵育时间来封闭非特异性抗原。
（3）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。
（4）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。
（5）适当稀释二抗浓度至出现特异性染阳性，而非特异性染保持阴性。
1、石蜡切片和冰冻切片的比较？
（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻
切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜/形态都较冰冻切片好。
2、一抗的选择要点和技巧是什么？
（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染（可以通过封闭等避免）。
（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。