中国人常见的药物代谢相关基因多态位点及其检测方法
杨琳艳;杨旭;范冬梅;梁志坤;叶倩平;杨学习
【摘 要】基因多态物代谢个体差异的一个重要来源是遗传多态性即药物代谢相关基因的多态性.中国人中药物代谢酶基因多态性的系统性分析已发现了很多潜在的功能性多态性位点,因此建立起针对中国人的药物代谢酶基因多态性的检测技术,对常见的药物代谢相关基因多态位点的检测以及针对这些多态性位点建立个性化用药技术具有重要的意义.检测药物代谢基因多态性大多采用传统的聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)等方法,随着基因诊断的快速发展,高通量、快速准确的基因多态性检测方法开始发展起来,如基因芯片法、下一代测序技术等.本文对药物代谢酶基因多态性位点及其检测方法进行综述.
【期刊名称】《分子诊断与杂志》
【年(卷),期】2017(009)005
【总页数】6页(P358-363)
【关键词】药物代谢;基因多态性;下一代测序技术
【作 者】杨琳艳;杨旭;范冬梅;梁志坤;叶倩平;杨学习
【作者单位】广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;南方医科大学检验与生物技术学院,广东,广州510515
【正文语种】中 文
药物在体内的作用过程包括药物的吸收、生物转化、分布和排泄等一系列过程。而其中的生物转化即为药物代谢，指的是药物在体内经过吸收、重新分布以后，在药物酶的作用下其化学结构发生一系列变化的过程。药物化学结构的变化包括其化学成分分子的缩合、降解以及分子功能团的增减和变换等。经生物转化后，药物相应的理化性质随之发生改变，进而导致其毒理和药理活性的变化［1⁃2］。对药物的代谢过程进行研究可以明确药物中发挥药效的活性成分，阐明药物的科学内涵，促进质量控制和剂型改进，进而指导临床用药。因此药物代谢研究对临床用药具有重要的指导意义。
遗传因素和环境因素共同影响着药物代谢酶活性的个体差异。其中与药物效应密切相关的药物相关基因即编码体内关键药物代谢酶的基因发生变化是主要的遗传影响因素。药物相关基因发生的诸如单核苷酸多态性、基因缺失或重复等分子结构变异，可能会引起药物在作用靶点、转运蛋白和代谢酶等水平上发生遗传差异，从而引起药物在体内的药效和代谢发生变化，对药物的效果产生影响，甚至会出现严重的药物不良反应，进而造成药物代谢和反应的个体差异［3］。
与药物效应相关的基因型分布具有较大的种族与地区差异，很多欧美人的相关数据不能直接应用到中国人。建立起中国人药物代谢酶基因多态性检测技术，对常见的药物代谢相关基因多态位点的检测以及针对这些多态性位点建立个性化用药技术具有重要的意义。
本文在前人研究的基础上，对中国人常见的药物代谢相关基因的多态位点及其对药物代谢过程的影响、常用检测方法特别是下一代测序技术在药物代谢基因多态性的检测中的应用进行综述。
CYP450在还原状态下可以和一氧化碳相结合，在450 nm的波长处有最大吸收峰，是存在于人体肝脏的具有混合功能的氧化酶。CYP450是药物代谢的最主要途径，是最重要的药物代
谢酶系，其负责的药物代谢超过80%，催化的氧化反应类型极广，与代谢物的相互作用关系也最为密切［4］。
CYP450的活性存在种族和个体差异，即具有遗传多态性。用药情况应根据患者的个体情况而异，这就需要首先确定患者与药物代谢相关的基因型，接着对其代谢类型做出判断，进而针对不同的个体确定不同的用药量，以达到最好的疗效。但从临床用药的现状来看，个体化用药的目标还远没有实现，主要原因有：一是CYP450s基因型鉴定技术还不完善；二是CYP450s基因型与表现型的关系研究得还不够深入［5］。因此，针对这一现状，发展经济、高效、准确的CYP450s相关基因型鉴定技术，深入开展CYP450s基因型与表现型关系的研究工作对于降低药物不良反应、指导个体化临床用药具有重要意义。
CYP1A2在人类肝脏中普遍存在，在肝脏的线粒体和内质网中有大量分布，脑、肠道、肺等组织中有少量的分布，约占肝脏CYP450酶总量的13%［6］。CYP1A2主要的突变体为CYP1A2*11，是由CYP1A2基因c.558C＞A的突变引起其蛋白质（p.Phe186Leu）的改变，进而导致其酶活性的降低。CYP1A2*7是由于c.1253+1G＞A突变引起剪切缺陷（splicing defect）［5］。
占CYP2C亚族26%的CYP2C8酶，在肝脏中的含量较高，占肝酶总量的7%，在肝外其他组织中也有少量的分布，是CYP2C亚族成员中发现最晚的一个［7］。据统计，临床上约5%的药物代谢需CYP2C8的参与，另外该酶在血管紧张度和血压的调节以及一些内源化合物的代谢过程中也发挥着重要作用［8］。
已经报道的CYP2C8突变体有20多种，其分布特点是具有明显的地区性和种族性。其中，CYP2C8*2的突变频率为6%～28%，主要见于黑种人中。突变频率分别为13%和6%左右的CYP2C8*3和CYP2C8*42种突变体主要分布在白种人中［9］。而CYP2C8*5至CYP2C8*14的突变体突变频率很低（＜0.2%），主要见于亚洲人［10］。
CYP2C9同样也具有基因多态性，据报道至少存在2种不同的等位基因即CYP2C9*2和*3［11］。作为CYP2C亚家族的主要成员，CYP2C9*3是中国人中最常见的突变型，占8%～10%，而其他突变型占不到1%［12］，CYP2C9具有显著的地区和种族差异。基因突变后可能会导致酶活力的下降，进而引起代谢能力的降低，CYP2C9*3突变是其酶活性下降的主要原因。
CYP2C9基因编码区有多处单核苷酸多态存在。第一个被发现的是CYP2C9*2，由于3号外显
子的430位C＞T，导致144位Arg变为Cys。CYP2C9*2与CYP2C9*1相比缺少AvaⅡ的识别位点（GGACT），因此可以使用 PCR检测 P450CYP2C9*2。第二个多态的位点是CYP2C9*3，7号外显子的1075位A＞C，导致359位的Ile变为Leu。CYP2C9*4是一种很少出现的等位基因，只在一位日本病人中发现过，在日本的健康人和其他人种中均未发现过，该基因7号外显子的1076位T＞C，导致359位 Ile变为 Thr［13］。
De Morais等［14］发现弱代谢者产生的主要原因是CYP2C19cDNA的5号外显子中发生c.681G＞A突变，导致了一个新的异常的拼接位点的出现，异常的拼接使位于外显子5’端的前40 bp的碱基缺失，在之后的转录过程中mRNA的阅读框架也发生改变，进而导致翻译提前终止，结果生成的蛋白质是无功能的酶蛋白，其结构上缺乏血红素结合位点。该突变体被称为CYP2C19*2。该突变存在于约73%～83%的日本人和白种人弱代谢者中［5］。另外，突变频率较高的突变体有CYP2C19*5、CYP2C19*8和CYP2C19*3等。CYP2C19*5表现为c.1297C＞T突变，并导致氨基酸产生p.Arg433Trp的改变。CYP2C19*8表现为c.358T＞C突变，导致氨基酸序列产生p.Trp120Arg的改变。而突变体CYP2C19*3则表现为c.991A＞G突变，导致氨基酸序列产生p.Ile331Val的变化，以及c.636G＞A突变［15］，导致氨基酸序列产生p.Trp212X的改变，翻译提前终止，丧失酶活性，造成弱代谢者的发生［14］。
CYP3A4是人类药物代谢酶中最主要的异构酶，约占肝脏CYP酶总量的25%［16］，肠道中也有大量CYP3A4酶的表达。临床上约有50%药物需经CYP3A4代谢［17］，该酶的代谢底物类型较多。目前为止，在中国人中已发现的CYP3A4突变体主要有CYP3A4*3（c.1334T＞C）、CYP3A4*4（c.352A＞G）［18］、CYP3A4*5（c.653C＞G）［19］和CYP3A4*18（c.878T＞C）。FK506是常用的免疫抑制药，主要用来预防肾脏移植后免疫排斥反应。其具有比环孢素更强的免疫抑制作用和肝肾安全性。在口服FK506后，主要利用肝脏和肠道中的CYP3A4和CYP3A5进行代谢，因此推测造成FK506药物动力学个体差异的主要原因可能是CYP3A4、CYP3A5的基因多态性。在已发现的CYP3A4的数十个SNPs中，IVS10上的CYP3A4*18B（82266G＞A）是目前在中国人中最高发的突变体［20］。与CYP3A4基因相似，CYP3A5基因具有很大的表达差异性，其中最常见的突变体是CYP3A5*3，即IVS3上产生c.219⁃237A＞G突变，进而导致异常剪切的mRNA的形成，编码形成的蛋白质表现出不稳定的特性，CYP3A5代谢酶在携带该突变的患者体内不表达，导致对相应底物的代谢效率下降，因此该突变被认为是影响CYP3A5蛋白表达水平的最主要因素［21］。
CYP2E1的代谢底物较多，其中大部分为前毒物和前致癌物，少部分为药物。该基因也具有
基因多态性。在中国人中主要发现两种该基因的突变体，即CYP2E1*2和CYP2E1*3。CYP2E1*2表现为c.227G＞A突变，并引起氨基酸p.Arg76His的改变，进而导致其酶活性降低。CYP2E1*3则表现为c.1165G＞A突变，并引起氨基酸p.Val389Ile改变的产生，但对酶活性并无明显影响［22］。
研究表明CYP2D6酶参与临床上20%～25%的常用处方药的药物代谢［23］，如异喹胍（肾上腺素能阻断药物）、司巴丁等。CYP2D6已知的等位基因变异超过了90个，同样也具有基因多态性，其中某些突变导致弱代谢表型的产生，使代谢能力下降，某些突变导致强代谢表型的产生，使代谢能力增加［24］。
CYP2D6的基因多态性具有种族和地区差异，在高加索人和非洲人中，CYP2D6*5的突变频率类似，在东方人中没有发现CYP2D6*3和CYP2D6*4突变的存在，因此只有很少的慢代谢者。在中国人和日本人中发现了CYP2D6*10突变体，表现为氨基酸p.Pro34Ser突变的产生，这是导致东方人CYP2D6酶活性降低的主要原因［25］。据统计东方人的CYP2D6*10基因突变频率高达50%，而高加索人仅为5%，这是后者代谢率高于前者的重要原因［24］。
甲硫氨酸合酶还原酶（methionine synthase re⁃ducta，MTRR）和亚甲基四氢叶酸还原酶（methy⁃lenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）等是叶酸代谢过程中的关键酶。叶酸相关代谢酶的编码基因同样也存在单核苷酸多态性，例如常见的MTRR基因的c.66A＞G、MTHFR基因的c.665C＞T突变和c.1286A＞C突变，这些突变可能会影响其相应编码产物的活性，进而影响叶酸的代谢［26］。