目录
引言 (1)
材料与方法 (3)
1.1研究对象 (3)
1.1.1 病例组 (3)
1.1.2 对照组 (4)
1.2试剂与耗材 (4)
1.3实验仪器 (5)
1.4实验方法 (5)
1.4.1 实验原理 (5)
1.4.2 技术路线 (8)
1.4.3 标本采集 (8)
1.4.4 标本DNA提取 (8)
1.4.5 DNA浓度和纯度的测定 (9)
1.4.6 Taqman探针荧光定量PCR技术 (9)
1.5统计学分析 (10)
结果 (12)
2.1病例组与对照组基础临床资料的比较 (12)
2.2对照组H-W平衡检验 (12)
2.3基因型和等位基因频率的分析 (13)
2.3.1 病例组与对照组基因型和等位基因频率的比较 (13)
2.3.2 轻度/重度子痫前期与对照组基因型和等位基因频率的比较 (14)
2.3.3 早发型/晚发型子痫前期与对照组基因型和等位基因频率的比较 (14)
2.4基因型-表型相关性分析 (15)基因多态性
讨论 (18)
结论 (21)
参考文献 (22)
综述 (25)
综述参考文献 (32)
攻读学位期间的研究成果 (37)
缩略词表 (38)
致谢 (39)
学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 (40)
1
引言
引言
妊娠高血压综合征是妊娠期妇女特有的疾病，其中子痫前期是妊娠高血压综合征中较为严重的一种类型，它以妊娠20周以后新发的高血压（≥140/90mmHg）和蛋白尿（≥300 mg/24 h）为特征，且常伴发肝、肾、中枢神经系统、凝血系统等多脏器及多系统的损害[1]。其发病率在国内外有所差异，据报道我国发病率为9. 4%，国外发病率为7% ~ 12%，且近几年其发病率呈上升趋势，严重威胁着孕产妇和胎儿的生命安全[2]。尽管国内外学者对其病因及发病机制已做了大量研究，但至今仍没有一种学说可以完全阐明其发病机制。目前，被广泛认可的发病因素包括：炎症反应、免疫平衡紊乱、氧化应激以及遗传因素等[3-5]。
研究表明，氧化应激在子痫前期的发病中发挥着重要的作用[6,7]。氧化应激是指体内活性氧（如：氧自由基、过氧化氢、羟自由基等）与抗氧化物（如：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、超氧物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶、维生素C、维生素E等）之间的平衡发生紊乱，活性氧占优势的一种过氧化状态[8-11]。活性氧可以通过氧化损伤生物分子、启动脂质过氧化过程以及引起细胞功能异常等产生一系列的有害作用[12]。子痫前期孕妇体内活性氧增多或抗氧
化物减少导致活性氧占优势而发生氧化应激，进而引起内皮功能障碍并最终导致子痫前期的病理过程及临床表现[11]。
谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）是一种活性很强的抗氧化酶，它可以将过氧化氢、脂质过氧化物等活性氧还原成水及相应的无活性的醇类，从而阻止氧化应激的发生发展，避免其对机体的氧化损伤[13]。H.D. Mistry等研究发现，与正常对照组孕妇相比，子痫前期孕妇胎盘中GPx4蛋白表达水平下降；L. Roland-Zejly等研究发现，子痫前期孕妇胎盘中GPx4 mRNA水平也比正常对照组孕妇下降[14,15]。这些研究表明GPx4表达水平的下降可能在子痫前期的发生发展中起着重要的作用。另外，研究发现，遗传因素在子痫前期的发病中也发挥着重要作用，并且已证实，多种基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与子痫前期的发病及遗传易感性具有密切关系，例如：Survivin 基因、内皮型一氧化氮合酶基因、血管紧张素原基因、血管紧张素转换酶基因、凝血酶原基因、VLeiden 因子基因以及肿瘤坏死因子α基因等[16]。因此，我们推想GPx4基因可能在子痫前期的发生发展中起着关键作用，该基因的SNP可能与子痫前期的发病及遗传易感性具有密切关系。
GPx4基因位于19p13.3，由7个外显子和若干内含子组成。该基因多态性会影响其产物的表达水平及抗氧化功能[17]。rs713041和rs4807542是GPx4基因的两个标签SNP位点，可能也会影响GPx4的基因表达和产物功能。其中，rs713041位点位
1
于GPx4基因的3′UTR位置上，它可以通过一定机制调节GPx4蛋白的合成[18]。而且，这个位点的多态性还与脂质代谢以及某些癌症的发生有关[19-22]。rs4807542位点位于外显子，它虽然不是一个公认的功能性多态性位点，但rs4807542位点与rs713041位点经连锁不平分析后，发现二者与大骨节病的发病有相关性[18]。这两个位点均位于外显子并且可能会影响基因表达[18]，因此研究这两个标签SNP位点多态性与子痫前期遗传易感性的关系有重要的意义。
本研究选取1008例PE患者作为病例组，1386例健康足月妊娠妇女作为对照组，采用TaqMan探针荧光定量PCR技术检测两组研究对象GPx4基因rs713041位点和rs4807542位点的基因分型，旨在探讨山东汉族女性GPx4基因多态性与子痫前期的遗传易感性是否相关。
2
材料与方法
3
材料与方法
1.1 研究对象
本实验研究对象均来源于2013年1月~2015年12
沂临沂市人民医院、聊城市人民医院、烟台毓璜顶医院、滨州医学院附属医院、枣
庄市妇幼保健院、菏泽市立医院等山东各地医院产科住院的汉族妊娠妇女。所有研属医院伦理委员会的审查批准。
1.1.1 病例组
本研究选取1008例子痫前期患者作为病例组，平均年龄（30.45±5.06）岁。子痫前期诊断标准参照美国国家高血压教育项目工作组（National High Blood Pressure Education Program Working Group ）的报告（2000）和第23版《Williams Obstetrics 》的诊断标准，即：妊娠20周以后出现高血压（≥140/90mmHg ）和尿蛋白（≥300mg/24h 或1+），并且可伴有头痛、视力模糊、上腹不适等其他临床症状[23]。参照美国妇产科医师协会（the American College of Obstetricians and Gynecologists, ACOG ）2002年的公告[24]和谢幸等主编的第八版«妇产科学»（人民卫生出版社出版）将子痫前期病例组进一步分为轻度子痫前期和重度子痫前期，符合下述任何一种情况的子痫前期患者即可诊断为重度子
痫前期：
（1） 血压持续升高：收缩压≥160mmHg 和（或）舒张压≥110mmHg ；
（2） 蛋白尿≥5.0g/24h 或随机尿≥（+++）；
（3） 脑神经症状：头痛、头晕、视觉障碍等；
（4） 肝包膜下血肿或肝破裂症状：上腹部不适或持续性上腹部疼痛等；
（5） 肝脏功能异常：血清转氨酶升高；
（6） 肾功能异常：少尿（尿量＜400mL/24h 或＜17mL/h ）或血肌酐＞
106μmol/L ；
（7） 低蛋白血症伴胸腔积液或腹腔积液；
（8） 血液系统异常：血小板持续性下降并低于100×109/L ；血管内溶血（贫血、黄疸或血清乳酸脱氢酶升高）；
（9） 心力衰竭、肺水肿；
（10） 胎儿生长受限或羊水过少。
早发型子痫前期是指在妊娠34周之前就已经确诊为子痫前期的患者[25]。
4
1.1.2 对照组
本研究随机选取1386例正常妊娠妇女作为对照组，平均年龄（30.25±3.91）岁。其纳入和排除标准如下：
（1） 年龄≥26周岁；
（2） 孕周≥30周；
（3） 妊娠期血压正常；
（4） 辅助检查：血常规，血凝常规，生化/肝肾功以及尿常规均正常；
（5） 既往无子痫前期病史，无慢性高血压、心脏病、肝脏疾病、肾脏疾病、糖尿病病史，无输血史及免疫史；
（6） 本次妊娠非人工授精，且无前置胎盘、胎膜早破、先兆流产、双胎或多胎妊娠、巨大儿等产科并发症。 1.2 试剂与耗材
（1）
DNA 提取试剂盒（全血，溶液型） （北京百泰克生物技术有限公司） 主要成分：红细胞裂解液（100mL ）、细胞核裂解液（33mL ）、蛋白沉淀液（11mL ）、DNA 溶解液（20mL ）
（2） 红细胞裂解液 （自己配制） 主要成分：蔗糖（分析纯）（109.54g ）、1M Tris-HCl （10mL ）、1M MgCl 2（5mL ）、Triton X-100（10mL ）
配制方法：依次加入上述试剂后，加蒸馏水充分溶解并定容到1000mL ，用1M NaOH 调pH 至7.2~7.4，室温过夜后，充分颠倒混匀，分两瓶装（规格500mL ）储存2周以上，待反应完全后方可使用。
（3）
异丙醇（分析纯） （江苏强盛功能化学股份有限公司） （4） 75% 乙醇 （河北健宁药业有限公司）
（5） Taqman 探针 （Invitrogen ，USA ）
（6） Taq 酶体系（Mix ） （Invitrogen ，USA ） 主要成分：Taq 酶、Mg 2+、dNTP 、Rox 染料、缓冲体系等
（7） 高压灭菌双蒸水
（8） EDTA 抗凝采血管 （新康医疗器械有限公司）
（9） 一次性静脉采血针 （新康医疗器械有限公司）
（10）
一次性 PE 手套 （北京鸿跃创新科技有限公司）
发表评论