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( 收稿日期: 2014-03-27)
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C Y P3A4
*
1G 基因多态性及功能的初步探讨
贺宝霞1 ，赵秀莉1 ，石磊2，赵树进
2
( 1．郑州大学附属肿瘤医院药学部河南郑州450008; 2．广州军区广州总医院药学部广东广州510010)
摘要: 目的:  采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4* 1G 多态性对CY P3A4 基因转录活性的影响。方法: 构建含CY P3A4* 1G 突变位点的荧光素酶基因表达载体，用L i p o fectam i ne2000 转染H epG2 细胞，化学发光法检测荧光素酶活性。结果: 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示，pG L3-pr o m o ter-A 质粒转染后荧光素酶活性显著高于pG L3-pr o m o ter-G(P =0． 022 ＜0． 05) 。结论:  CY P3A4* 1G 能够增强荧光素酶基因的表达，可能增强CY P3A4 基因的转录活性。
关键词: 细胞素P4503A4; 基因多态性;  双荧光素酶报告基因系统
中图分类号: Ｒ394-33doi: 10．3969/j． i ss n．1004-437X2014．07．002
P r e li m i na r y study of the function of CYP3A4* 1G p o l y m o r ph i sm
HE B a o x i a1，ZHAO X iuli1 ，SHI L e i2，ZHAO Shujin2
( 1．Department  of  P h a rm a cy，Aff ilia ted  Ca ncer Hosp i t al  of Zhengzhou  U n i vers i ty，Z hengzhou  450008，China; 2．Department  of
P h a rm a cy，Gu a ngzhou Gener al Hosp i t al of Guangzhou  Military Command，Guangzhou 510010，China)
A bst r ac t:  O bjec tiv e:  To ana l yze the effects of CYP3A4* 1G p o l ym o rph i sm on t he t ranscr i p t i o na l activity of t he CYP3A4 gene by the dua l luciferas e reporter assay sys t em．Methods: The luciferase gene p l asm i ds c o n t a i n i n g the CYP3A4* 1G mutated s i t es was constructed by g ene t i c en g i neer i n g．The human hepatoma cell line，HepG2，was used for t ransfec t i o n w i t h the p l as m i d constructs by li- p o fec t am i ne2000．Ｒes u l t s: The res u l t s of t he dual l uciferas e reporter assay system i nd i ca t ed t ha t the I V S10+ 12A construct showed h i g her luciferas e ac tivity than the I V S10+12G c onstruct ( P =
基金项目：国家自然科学基金项目( 81302796) ，河南省医学科技攻关计划项目( 201203148) 。
通讯作者：赵秀莉，E-ma il: hnz ha o x i@126．c o m。
No ． 7
·
0． 022) ．C onclusion : The CYP3A4* 1G is ab l e  t o enhanc e t he ex press i o n  of t he luciferas e g ene ， wh i ch  i mplies that it may enhance the t ranscr i p t i o na l ac tivity of CYP3A4 g ene ． K e yw o r ds :  CYP3A4;  g ene t i c  p o l ym o rph i s m ;  dua l l uciferas e reporter assay sys t em
细胞素 P 450
( cytochrome P450，CYP ) 是由结构 和功能相关的基因超家族编码的同工酶所组成的超家 族酶系，主要包括 CYP 1 ～ 4 四个家族和 A 、B 、C 、D 、E 等亚家族，是肝微粒体中最重要的混合功能氧化酶，参 与大量的外源性物质 ( 药物、化学毒物、致癌 物 等) 和 内源性物质( 类固醇激 素、维 生 素 D 、胆 酸 等) 的 代 谢
过程。CYP3A4 是 CYP3A 亚家族中最主要的成员，占 P450 酶系 总 量 的 30% ～ 40% ，主 要 分布在肝脏和肠 道，与目前 临 床 50% 以 上 的 常 用 药 物 相 关。C Y P3A 4 在人体内的表达差异高达 40 倍，其底物的代谢差异达 10 倍以上，这种差异主要是由于单核苷酸多态性引起 的。迄 今 为 止，已 发 现 40 个单核苷酸多态性，其 中 C Y P3A 4* 1G  即 I V S10 + 12G  ＞ A 在中国人中分布
的片段，
P C Ｒ 反应体系为: rTaq DNA  聚合酶 2． 5 U ，2． 5 mm o l / L dNTP 2． 0 μl ，10 × P C Ｒ buffer 2
． 5 μl ，上、下游 引物( 10 μm o l / L ) 各 1 μl ，DNA 模板 100 n g ，灭菌水补 充至 25 μl 。扩增反应条件: 94 ℃ 预变性 7 m i n ; 94 ℃ 变性 30 s ，50 ℃ 复性 30 s ，72 ℃ 延伸 45 s ，共 35 个循 环; 72 ℃ 延伸 7 min 。
P C Ｒ 产物经凝胶回收纯化后连接 pMD 20-T 载体 并转化 E ． c o li  JM109 感受态，阳性克隆子送 I nv i t r og en  公 司 测 序。 阳性质粒经提取 后，重 组 质 粒 pMD - CYP3A4 和表达载体 pG L 3-pr o m ot er  进行 M l u I  / X h o I  双 酶切并纯化后用 T4 连接酶连接，转化 E ． c o li  JM109 感
受态细胞，氨苄青霉素 ( Amp ) 筛选，对初步筛选 出 的 阳性重组菌经质粒抽提，双酶切 M l u I  / X h o I  电泳鉴定， 并设空载体作对照。同时菌液送 I nv i t r og en  公司测序。 频率最高，约占22． 1%［1］
。本文 拟 探 讨 C Y P3A 4
* 1G 酶 活 性 的 影 响，为 今 后 研 究
pG L 3-pr o m oto r -A 的 构 建 与 鉴 定:
多 态 性 对 C Y P3A 4 1． 2． 2
pG L 3-pr o -
CYP3A4* 1G 多态性对 CYP3A4 底物药物药动学和药 效学的影响奠定基础。
m ot er -A 的构建采用重叠延伸 P C Ｒ 法。引物设计根据
重叠延伸 P C Ｒ 定点诱变技术的原 理［2］，合 成 4 条 引 物，两条为外侧正、反向引物，两条为诱变引物。正向
1 材料和方法
试剂和仪器 外 侧 引 物 序 列 为: 5 ’-AAA C T CG A G C A CCC T G AT - F pG L 3-pr o m ot er  载体、p ＲL -S V 40 载
， 反  向  外  侧  引  物
序  列: 1． 1
G T C -3 ’
Ｒ    5 ’-
体、双荧光报告系统试剂盒和 Wiz ard Ma g neS il Tfx Sys - tem  均购自 Promega 公司，限制性内切酶
X h o I  和 M l u I 、 T 4-DN A 连接酶、pM D 20-T 载体、A g ar o se  Gel DNA Pur - i f i c a t i o n  Ki t  V er ． 2． 0、MiniBEST Plas mi d P ur i f i c a t i o n  Ki t  V er ． 2． 0 均购自 Takara 公司，OP T I -M E M 、L i p o fec t am i ne  2000 购自 I nv i t r og en  公司。G l o Max  生物发光检测仪为 Promega 公 司 产 品，I X 70-121 普 通 倒 置 显 微 镜 为 日 本 OLYMPUS 公司产品，凝胶成像分析系统为 美 国 B I O - ＲA D  公司产品。 AAAA CG CG TAA G C A G AT G AA CC -3’，在此对引物中引 入 M l u I  和 X h o I  的酶切位点( 下划线部分) 。两条诱变
引物 为 Fm 和 Ｒm ，
F m  序 列 为: 5 ’-T C C TT C T C C AT
G - TAT C AT CC A C T C A CC TT -3 ’，Ｒm  序 列: 5 ’
-AA G G T - G A G T G G AT G ATA C AT G G A G AA G G A -3’，F m  和 Ｒm 均 含有希望引入的突变位点( 以下划线标出) 。
重叠 延 伸 PC Ｒ 法 需 要 3 个 P C Ｒ 反 应 来 完 成。 P C Ｒ 反应条件相同，反应体系均为 20 μl ，Ex Taq DNA DNA 聚合酶 ( 5 U  / μl )  0． 2 μl ，2． 5 mm o l / L  dNTP 1． 6 μl ，10 × Ex Taq buffer 2． 0 μl ，M g C l 2 ( 25 mM ) 1． 6 μl ， 上、下游引物( 10 μm o l / L ) 各 1 μl ，DNA 模板 1 μl ，灭 菌水补充至 20 μl 。P C Ｒ 反应条件为 95 ℃ 变性 5 min ; 1． 2 1． 2． 1
检测方法 pG L 3-pr o m ot er -G  的构建与鉴定:  应用 P C Ｒ 技
术，扩增 CYP3A4 基因目的片段，根据 GeneB ank 中的 CYP3A4 基 因 序 列 ( AF 280107． 1 )  设 计 对 扩 增 95 ℃ 15 s ，60 ℃ 15 s ，72 ℃ 20 10 min 。
s ，30 个 循 环; 72 1 ℃ CYP3A4 基因目的片段的引 物: 上 游 引 物 P1: 5 ’- AAA C T CG A G C A CCC T G AT G T C -3’，添 加 一 个 X h o I  识 第 3 次 P C Ｒ 产 物 用 1% 琼脂糖凝胶电泳进 行 鉴 定。重组质粒方法同前。重组质粒送  I nv i t r og en  公司 测序鉴定。阳性重组质粒命名为  pG L 3-pr o m ot er -A 。 别 位 点 下 划 线 序 列 ) ;  下 游 引 物 ( P2:  5 ’- AAAA CG CG TAA G C A G AT G AA CC -3’，引 入 了 M l u I  酶 切位点
( 下划线序列) 。以 C Y P 3A 4 * 1G 野生型人基 因组 DNA 为模板，以 P1、
P2 引物扩增 CYP3A4 基因目 细胞培养及质粒转 染:  将成功构建的含
1． 2． 3
CYP3A4 点突变的荧光素酶质粒 pG L 3-pr o m ot o r -G  及
·
No ． 7
pGL3 pr o m oto r -A ，用质粒提取试 剂 盒 Wizard Ma g neS il  Tfx System 提取 转 染 级 质 粒，操作步骤按说明书。用 L i p o fec t i n  2000 转 染 HepG2 细 胞，10% FBS 的 DMEM 培养基。转染 48 h 后收集细胞，进行荧光素酶的活性 检测。每个表达载体分别做 3 次分析，每次转染和测 定都做重复管，取其平均值。 荧光素酶的发光值 ( M1) ; 再加入 100 μl 的 反 应 终 止
液( St op ＆ G l o  Ｒeagent ) ，测定作为参照的海肾( Ｒen il - la ) 荧光素酶的发光值( M2) ，两者的比值 M1 / M2 即为 该质粒转染细胞所得的荧光素酶的相对活性。 1． 3 数据处理  所有数据均用 SPSS 13． 0 统计软件 －
进行处理，定量资料用均数 ± 标准差 ( x ± s ) 表 示，组
间比较进行 t 检验，
P ＜ 0． 05 为差异具有统计学意义。 1． 2． 4
荧光素酶活性检测:  按 Promega 公司 提 供 的
双荧光素酶检测方法进行，用 1 × PBS 洗涤细胞 2 次， 2 结果
重组质粒 PC Ｒ 产物及双酶切鉴定结果  重组质 再加 入 100 μl 的 被 动 裂 解 液 ( passive  lysis buffer ， PLB ) ，室温轻微振荡 15 m i n ，收集细胞裂解液。冻融 后 4 ℃ 12 000 r
/ m i n  离心 5 mi n 。吸取 20 μl 上清液加 入 100 μl L A Ｒ II 工作液，混合后测定萤火虫( Firefly )
2． 1 粒 P C Ｒ 产物为 305 bp ( 如图 1A ) ，重组质粒成功被双 酶切( 如图 1B ) 。
A : 以 P1 和 P2 为引物进行 P C Ｒ 的产物，M : 50bp Marker ，1 ～ 8: 随机挑取的 8 个单克隆;
B : pG L 3-
C YP 3A 4 重组质粒经 M l u I  + Xho I 酶切结果。M :
D L 5000。
图 1  重组质粒 pGL 3 -pr o m o ter -G  的 P C Ｒ 产物( A ) 及酶切鉴定( B )
2． 2  p G L 3-p r omote r -G 和 p G L 3-p r omote r -A 荧光素
酶报告基因的活性比较    不包含 CYP3A4 基因片段的 pG L 3-pr o m ot er  载 体，此实验中作为重组载 体 的 对 照 组。瞬时转染 HepG 2 细胞 48h 后进行荧光素酶报告 基
因活性的检测，质粒 p ＲL -S V 40 作为内对照共转染。
3 讨论
CYP3A4 是人体内重要的 CYP450 酶系，参与体内 外众多物质的生物转化，代 谢 约 50% 的 临 床 常 用 药
物，包括他汀类药 物、免 疫 抑 制 药、抗 肿 瘤 药 物 等。
CYP3A4* 1G 首次在日本人中发现［3］，在中国人中
结 果 发 现 转 染 细 胞 后，pG L 3-pr o m ot er -A 与
HepG2 pG L 3-pr o m ot er -G  相比，报告基因荧光素酶活性显著增 强( P = 0． 022 ＜ 0． 05) ，见图
2。
［1］
的分布分率为 22． 1% 。本研究首次采 用 双 荧 光 素
酶报告基因系统分析 CYP3A4* 1G 对 CYP3A4 酶转录
活性的影响。重组质粒 pG L 3-pr o m ot er -G  和 pG L 3-pr o - m ot er -A 转染肝癌细胞 HepG 2 48h 后，pG L 3-pr o m ot er -A 质粒的荧光素酶活性显著高于  pG L 3-pr o m ot er -G  质粒 ( P  ＜ 0． 05 ) ，提 示  C Y P3A 4 *  1G  多态性能够增强  CYP3A4 基因的转录活性。
CYP3A4* 1G  多态性对 CYP3A4 酶活性的影响，目 前国内外的研究结果并 不 一 致。Hu 等［4］
研 究 提 示，
CYP3A4*  1G 导 致 代谢酶的活性增 高。 Qiu 和 Du
［5-6］
等
研究结果都显示，
*  1G 等位基因可能使 C Y P3A 4 酶的活性增强，加快对底物的代谢，进而降低药物疗效， 与本研究结果一 致。 A n g i o lill o 、
Zhan g 、Y uan  和 Ga o  * 表示 P ＜ 0． 05。
图 2  I V S10 + 12G ＞ A  基因多态性对 CY P 3A4 基因转录活性的影响
No． 7 ·
等［7-10］研究资料显示，*1G等位基因可能使CYP3A4 酶的活性降低，减慢对药物的代谢，进而提高疗效。
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［6］
综上所述，CYP3A4 *1G 多态性可能增强
C Y P3A4基因的转录活性，但仍需要采用体内探针药
物、硝苯地平等进一步确定C Y P3A4*1G 多
态性对CYP3A4 酶活性的影响。［7］
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( 收稿日期: 2014-03-22)［5］
新乡市汉族孕龄女性
研究
M T H FＲ与M TＲＲ基因多态性
卢光荣1 ，鲁衍强2 ，马少杰2 ，马爱娇1 ，王鹏1，王晓玲1 ，杨琦3
( 1．新乡市妇幼保健院遗传室河南新乡453000; 2．上海靶向分子医学研究所上海200433; 3．中国
100013)
疾病预防控制中心妇幼保健中心北京
摘要: 目的:  探讨新乡市汉族孕龄女性M THFＲ、M TＲＲ基因多态性的频率特征。方法: 以新乡市1 352 例汉族孕龄女性为研究对象，检测M THFＲ677T、A1298C和M TＲＲ A66G 的基因分型。统计分析基因多态性的频率特征，并与已报道的其他地区汉族女性的数据进行比较。结果:  新乡市汉族女性的M THFＲ C677T 基因型和等位基因频率，与淄博、镇江、武汉、昆明、德阳、惠州、琼海等地的差异有统计学意义( P ＜0．05)。M THFＲA1298C 基因型和等位基因频率，与镇江、武汉、昆明、德阳、惠州、琼海等地的差异有统计学意义。M TＲＲ A66G 基因型和等位基因频率，与德阳、琼海的差异有统计学意义。结论:  新乡市汉族孕龄女性M THFＲ和M TＲＲ基因多态性频率分布具有地域特异性。
关键词: 亚甲基四氢叶酸还原酶;  甲硫氨酸合成酶还原酶;  多态性
中图分类号: Ｒ394-33doi: 10．3969/j． i ss n．1004-437X2014．07．003
P o l y m o r ph i sms of M T H FＲand M TＲＲgene among the H an gestational age women in Xinxiang c i t y
基金项目：中国疾病预防控制中心妇幼保健中心妇幼保健分子遗传医学研究专项计划(  F Y-Z X-Z D-0061)。通讯作者：马少杰，E-ma il: m asha o ji e@g enech i na．c o m。