多次反复核酸检测在新型冠状病毒肺炎疫情防控中的意义
摘要：核酸检测是新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）筛查的主要手段。影响核酸检测准确性的众多因素中，标本类型的不同、采集标本的时期、操作者采集标本的方法最为重要。多次反复核酸检测可以弥补检测试剂盒阳性检出率低的不足，避免病毒“窗口期”和不同采样者操作不到位等因素对检测结果的影响，提高阳性检出率。
关键词 核酸检测；新型冠状病毒肺炎；标本
Key words：nucleic acid testing；COVID-19；sample
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）目前已成为危害人类健康和经济发展的最大难题之一，截止目前，COVID-19已经蔓延至全球231个国家和地区，累计确诊病例超过3亿。目前，疫情进入常态化防控阶段，各地散发疫情时有出现。发生疫情后，当地会组织多次大规模核酸筛查，对重点人反复进行核酸检测，通过整理相关文献，探讨多次反复核酸检测的意义，为更好地开展核酸筛查工作提供一定的理疗依据。
1 新型冠状病毒的特点
新型冠状病毒（2019 new novel coronavirus，2019‑nCoV）是颗粒状病毒，属于β 属冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60~140 nm[1]，病毒上有规则排列的突起，形似皇冠而得名冠状病毒，用普通光学显微镜是无法观察清楚的，必须要借助电子显微镜，才能清楚地探查它的结构。在病毒感染早期，病毒个体小、数量少，想要直接观察病毒，需要对其进行体外培养，达到理想的病毒数量后，进行复杂的样品制备，才能在电子显微镜下进行观察。这一过程不仅繁琐，费用也十分高昂，显然不适合2019‑nCoV的快速筛查，因此，必须到一种方便快速、费用低廉的检测方法。2019‑nCoV主要由蛋白质和核酸构成，其携带的核酸是核糖核酸（RNA），如果能检测出2019‑nCoV的蛋白质或RNA，也就能证明病毒的存在。因此，蛋白质和核酸都可以作为检测目标，而核酸可以在体外扩增，检测的敏感性又大于蛋白质，因此核酸检测成为了新型冠状肺炎病毒筛查的主要手段。
2 新型冠状病毒核酸检测的意义
新型冠状病毒核酸检测是一种病原学检测手段。核酸是所有已知生命体必不可少的组成物质,每一物种都有独特的核酸序列,运用特殊手段，针对新型冠状病毒核酸RNA的特征序列进行检测,就可以为确诊新型冠状病毒感染提供直接的证据。COVID-19的核酸检测主要包括两种分
析方法[2]。第一种是对患者呼吸道或血液标本中病毒颗粒的核酸序列进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time Fluorescent Quantitative PCR，RT-qPCR) 分析， 核酸检测呈阳性则可临床确诊。该方法依据COVID-19的全基因组序列，选择病毒ＲNA 序列上相对高度保守的序列作为检测的目标序列。中国疾病预防控制中心发布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列分别为COVID-19的开放读码框1ab( Open reading frame，OＲF1ab) 和核壳蛋白( Nucleoprotein，N 蛋白) 基因区域[3]。除了这两个基因以外，有的公司还生产了包含COVID-19小包膜糖蛋白( Envelopeprotein，E 蛋白) 基因检测的试剂盒，可以通过三重荧光PCＲ对COVID-19 进行更准确的分析[4]。为使核酸检测结果更可靠，通常还会加做抗体检测，检测血清中特定抗体的含量。通过检测患者血液中新型冠状病毒 IgM 和 IgG 抗体,有助于临床医生判断患者病毒感染所处的时期。SARS-CoV-2感染人体后，其抗原可在１～５ｄ产生，IgM抗体可在感染５～７ｄ产生，IgG 抗体可在感染１０～１５ｄ产生[5]。有研究[6]表明，在COVID-19疑似组17例病例中，有2例患者IgM和IgG抗体同时阳性，且复查结果仍然均为阳性，这２例患者均有COVID-19流行病学史和典型的临床表现，肺部ＣＴ提示双肺磨玻璃影，淋巴细胞百分比和绝对值均降低，流式细胞分析显示自然杀伤细胞（ＮＫ细胞）减少，临床高度怀疑为COVID-19，但核酸检测结果始终为阴性。因此，在感染７～10ｄ后，检测S
ARS-CoV-2 IgM、IgG 抗体将是对核酸检测结果的补充，特别是对疑似COVID-19患者的辅助诊断和排除具有重要意义。目前最新版的诊疗方案[1]中将新冠病毒特异性IgM抗体阳性列为了疑似病例诊断依据之一。
3  影响新型冠状病毒核酸检测准确性的因素
COVID-19疫情发生以来，出现了大量多次核酸检测结果阴性的确诊病例[7]。排除处于潜伏期等患者自身的因素，新型冠状病毒核酸检测工作包含了多个环节，从采样、标本保存与运输，到标本灭活、核酸提取、扩增体系等，每一个环节操作失误或者试剂、设备出现问题，均可能导致检测结果出现错误，造成“假阳性”或“假阴性”。
2019年12月COVID-19疫情发生以来，我国应对疫情已经取得的阶段性的胜利，对于新型冠状病毒核酸检测工作积累了大量的经验，核酸检测的实验室操作也趋于标准化、流程化，因此，影响核酸检测准确性的众多因素中，标本的采集、标本的保存与运输最为重要。
3.1不同标本类型对检出率的影响
COVID-19实验室检测标本类型分为：鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽提取物或呼吸道提取物、深
咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、消化道标本（包含粪便及肛拭子）、血液标本（包含全血及血清）[2]。由于新型冠状病毒造成的肺炎以下呼吸道感染为主，对于已有症状及出现肺部CT改变的患者来说,下呼吸道标本(如深咳痰液、灌洗液等)为核酸检测的首选,而在COVID-19不同病程中，提取取上呼吸道标本(如鼻咽拭子)也能检出病毒核酸。有大量研究[8-9]表明下呼吸道标本阳性率明显高于上呼吸道标本。但是通过气管镜等方法采集下呼吸道标本时，医护人员存在较大被感染的风险，且操作复杂，不适于人大规模筛查，所以目前仍以鼻咽拭子、咽拭子采集上呼吸道标本为主。拭子标本使用RT-PCR试剂盒进行检测，阳性检出率仅为40%-50%[10]，因此，必须进行多次取样检测或结合其他类型标本检测结果进行确认。
同时，为提高检测阳性率，有学者[11]建议采集同一患者多部位标本，合并进行检测。例如，用口咽拭子、鼻咽拭子同时采集标本，然后放到同一采集管中送检。对于有消化道症状的疑似患者，可同时采集粪便或肛拭子进行检测。
3.2不同时期病毒载量的影响
COVID-19处在不同病程、不同病情的患者机体中病毒存在量可能不同，部分患者即使已有
病毒感染，但在标本采集部位病毒存在量较少或采集到的病毒载量太少，无法达到检测试剂盒的检测限，则可能导致用现有的实验室检测方法检测不到，从而出现“假阴性”结果。因此，为避免错过患者排毒高峰而造成核酸检测结果失真，在高风险地区或大范围流行期间，对临床高度疑似COVID-19的患者，或高风险地区人，应该连续多次采集标本进行核酸检测。
3.3 检测“窗口期”的影响
基于流行病学调查，COVID-19在人体内的潜伏期通常为1~14 d[2]。钟南山院士团队的研究[12]表明，COVID-19的中位潜伏期为3 d，最长可达24 d，但他们在1099 例病例样本中仅发现了1 例潜伏期为24 d。大多数新冠肺炎患者发病后第３～７天核酸检测可获得阳性结果，但可在病程第７天开始转阴[13]，故核酸检测阳性结果的窗口期较短，无论过早或过晚检测都可能得不到阳性结果，从而造成检测结果出现“假阴性”。
3.4标本采集方法对检测结果的影响
新型冠状病毒核酸采样所用的拭子是植绒拭子，鼻咽拭子采样不能只在鼻腔浅处取样，要插
入鼻腔深处并且旋转一圈，咽拭子采样时要在咽后壁及扁桃体隐窝侧壁等处反复擦拭3-5次，采样的准确性存在个人依赖性，如果采样者操作不到位，受检者反应较大而导致采样位置不对、力度和时间不够，都可能对检测结果造成影响，增加漏检率。
3.5 标本运输
核酸大规模排查时，受检测场所多为室外、检测人数较多等因素影响，采样标本储存与运输条件受限，可能在冷链储存与运输环节中出现差错，影响标本活性。随着技术的发展，目前使用的病毒采集液可在２～８℃保存，４８ｈ内使用并进行核酸检测，不影响核酸检测结果，但是仍有文献[14]表明运输时间较长会降低检测阳性率。
4  多次反复核酸检测的意义
4.1 弥补检测试剂盒阳性检出率低的不足，提高阳性检出率
目前大规模核酸筛查以鼻咽拭子、咽拭子采集上呼吸道标本为主，相较于下呼吸道标本来说，采集相对方便，但检出阳性率较低，而拭子标本试剂盒阳性检出率仅为40%-50%[10]，在现有的检测技术下，只能通过反复多次检测，避免漏检或“假阴性”结果，提高阳性检出率。
4.2 避免“窗口期”对检测结果的影响
    新型冠状肺炎病毒检测存在“窗口期”，过早或过晚检测都有出现“假阴性”结果的可能，在人大筛查时，无法确定采样时潜在感染者是否处在病毒检出的“窗口期”，如果仅仅采样一次，将有很大可能错过检出病毒的最佳时机，而对于同一受检者在不同时间反复多次进行采样，将大大降低“窗口期”对检测结果的影响，提高病毒的检出率。
3.3 避免不同采样者操作不到位对检测结果的影响
    新型冠状病毒核酸检测的对采样者的操作手法有一定的要求，采样者操作不当、采样部位不对、采样时间和采样力度不够都将影响检测结果。反复多次令不同采样者对同一受检者进行采样，可降低检测结果对采样者的个人依赖性，降低采样者对检测结果的影响。
5 提高核酸检测检出率的建议措施
  综上所述，多种因素均可能导致核酸检测结果出现“假阴性”。想要提高核酸检测检出率，可从以下几个方面入手：首先，优化核酸检测试剂盒的灵敏性和特异性，提升试剂盒的质量，
从而提高试剂盒的阳性检出率；其次，采样人员上岗前要经过严格的培训，保证核酸检测采样手法、部位、采样时间和力度达标，降低因采样工作人员操作不当对检测结果造成的影响；第三，采样部位以及样本内的病毒含量可能影响检测结果，对于疑似病例、高风险人，可采集同一患者多部位标本进行检测，必要时采集深部痰液样本或者肺泡灌洗液，并加做抗体检测，2种类型标本均检测得到单靶标阳性结果时,应判定核酸检测结果为阳性[2]；第四，样本的保存和运输也是影响检出率的重要一环，样本保存不当可降低核酸提取的质量，直接影响后续的定量分析，造成检出率降低。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第八版)》新冠病毒样本采集和检测技术指南，样品储存在一种特殊的病毒保存溶液中，含有RNA病毒的样品必须储存在4 ℃并尽快运输进行检查。24 h内无法检测的标本应置于–70 ℃或以下温度保存。血清标本可在4 ℃存放3 d，–20 ℃以下可长期保存[15]核酸检测结果阴性是什么意思。采集后的标本应严格按照储存条件要求及时送检，以提高检测的准确性，降低漏检率，真正达到筛查的目的。