国际生物制品学杂志202〗年2月第44卷第1期Im J Biologicals，February2021，Vol.44, No. 1•1 •
•新型冠状病毒专题•
新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆中新型
冠状病毒核酸检测方法的验证
王月1喻剑虹2刘莹3罗艳1郭佳茹1张林林1李璞1赵传波2陈玲1向阳|
张雪2陈鄂湘1彭干2李耀雄1何彦林3李策生4
1国药集团武汉血液制品有限公司质量控制室430207;2国药集团武汉血液制品有限公司
质量保证室430207;3国药集团武汉血液制品有限公司质量管理部430207;4国药集团武
汉血液制品有限公司科研开发部430207
通信作者：李策生，Email:l ic es h e n g@sinopharm. com；何彦林，Email:heyanlin@
sinopharm
【摘要】目的对新型冠状病毒肺炎（COVIEH9)康复者恢复期血浆中新型冠状病毒(2019 novel
coronavinis，2019-nCoV)核酸检测方法进行系统性验证。方法根据血浆样本实际情况，并结合试剂
盒要求，建立C()VII>19康复者恢复期血浆中2019-nCoV核酸的实时荧光定量PCR检测方法，并从专
属性、检测限(limit of detection,L O D h重复性及中间精密度对该方法进行系统性的验证，对2()份
c()v ir>〗y康复者恢复期血浆样本进行性能确认。结果专属性：阳性样本及阴性样本均能被有效检
出；检测限:1x LOD〜2 X LODjk业参考品19次检测开放阅读框la/b和/或核衣壳蛋白基因为阳性；重
复性和中间精密度：两种阳性对照基因以及内部质控在不同荧光通道的循环阈值的相对标准偏差均符
合要求。性能确认：康复者恢复期血浆2019-nCoV核酸检测结果均为阴性。结论该检测方法专属性
强、稳定可靠、重复性好，适用于C()Vir>19康复者恢复期血浆2(M9-nCoV核酸检测。
【关键词】新型冠状病毒肺炎；新型冠状病毒；核酸检测；恢复期血浆
基金项目：国家科技部重点专项(2020 YFC08418(.I0)
核酸检测结果阳性参考值阴性【中图分类号】R185 DOI： 10. 3760/cma.j311962-20201019-00102
Verification of 2019 novel coronavirus nucleic acid detection in COVID-19 convalescent plasma samples
Wang Yue'»Yu Jianhong2 , Liu Ying3 , Luo Yan 1 , Guo ]iaru 1, Zhang Linlin1，Li P u1, Zhao
Chuanbo2 , Chen L ing1, Xiang Yang1，Zfiang Xue2，Chen E:riang,，Petig Gan2，Li Yaosciong1，He
Yanlin3, Li Cesheng4
1 Quality Control Department，Sinopharm Wuhan Plasma-derived Biotherapies Co.，Ltd.，Wuhan
430207，China; 2Quality Aasurance Department，Sinopharm Wuhcui PUisma-derived Biotherapies Co.，
Ltd.，Wuhan 430207，China; 3 Quality Management Department，Sinopharm Wuhan Plasma-derived
Biotherapies Co.，Ltd.，Wuhan 430207，China; 4 Research ami Development Department，Sinophurm
Wuhcm PUisma-derived Biotherapies Co.，Ltd.，Wuhan 430207，Chirm
Corresponding authors :Li Cesheng，Email ••***********************;He Yanlin-, Email：heyanlin
@sinopharm. com
【Abstract】Objective To systematically verify the detection method of 2019 novel coronavirus
(2019-nCoV ) nucleic acid in convalescent plasma (C P)samples of COVID-19 patients.
Methods According to actual situation of plasma samples and requirements of the kit, a realtime
fluorescence quantitative PCR detection method for 2019-nCoV nucleic acid was established. The method
was systematically verified from specificity, limit of detection (LOD), repeatability and intermediate
precision. The method performance was validated by measurements of 20 CP samples. Results The
specificity results showed that both positive and negative samples were detected effectively. The LOD
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results revealed that the open reading frame la/b and/or nucleocapsid genes were positive in 19 times of
tests with 1X L()E)-2 X LOD concentration enterprise reference materials. Repeatability and intermediate
precision results showed that the relative standard deviations of cycle threshold values for both positive
control genes and internal quality control in different fluorescence channels all met the requirements. The
performance validation results displayed that 20 CP samples were all negative for 2019-nCoV nucleic acid.
Conclusion The method is specific, stable, reliable and repeatable, and can be applied for the detection
of 2019-nCoV nucleic acid in COVID-19 CP samples.
【Key words】C〇VID~19; 2019 novel coronavirus; Nucleic adds detection; Convalescent plasma
Fund program：Key Project of the Ministry of Science and Technology of China (2020YFC0841800)
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20201019-00102
新型冠状病毒肺炎（COVII>19)是由新型冠状 病毒（2019 n o v e l coronavir u s，20i y-nCoV)感染引 起的急性传染性疾病W。目前各国正在开展针对 COVII>19的抗病毒药物和疫苗的临床试验[2]。C〇VII>19康复者恢复期血浆能够显著 改善重症患者的临床症状并降低病毒载量，且安全 性良好[3]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七 版)》等文件中，康复者恢复期血浆被正式列为 重型和危重型病例的方法，主要适用于病情进 展较快的重症和危重症患者[4_5]。
本研究的目的是建立一种检测COVIEM9康复 者恢复期血浆中2019-nCoV核酸的检测方法，根据 国家卫生健康委员会临床检验中心卫检中字[2020] 第7号《新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆实验 室检测质量控制要求》[6]，结合方法自身特点，分别 从专属性、检测限（l i m i t o f d e t e c t i o n,L O D)、重复 性以及中间精密度进行系统性验证，并对20份 COVII>19康复者恢复期血浆进行性能确认。
1材料与方法
1.1研究对象
20份COVII>19康复者恢复期血浆主要由湖 北省COVIIM9康复者捐献，1x L O D〜2X L O D企 业参考品（批号:CO V001N、C O V()()2N、C O V003N，规格:50()拷贝/ml)购自上海捷诺生物科技有限公司。
1.2主要仪器及试剂
G N-96S型GNCycler多重病原微生物核酸检 测系统购自上海宏石医疗科技有限公司，QIAamp® MinElute® Virus Spin Kit核酸提取试剂盒（批号: 163052734)购自德国 QIAGEN 公司，2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光P C R法）（批号：nCOV202(m)()l)、单管多重呼吸道病原体检测试剂 盒(批号：R F V2()2()()()1)购自上海捷诺生物科技有限公司。
1.3 COVIEM9康复者恢复期血浆中2019-nCoV 核酸检测方法的建立
1.3.1血浆核酸样本提取采用核酸提取试剂盒提取血浆核酸样本，由于相比呼吸道样本，血浆样本 比较黏稠，因此将蛋白酶K使用量增至3() /x l，将洗 脱试剂的使用量增至600 ^1，同时取200 y稀释液 作为阴性对照。然后向血浆样本和阴性对照中分别 加人5 )u l RespiFinder内部质控（来自病原体试剂 盒)。
1.3.2 2019-nCoV核酸检测扩增扩增引物和探针序列如下。靶标开放阅读框l a/b(open r e a d i n g frame l a/b，ORFlafe)正向引物：C C C T G T G G G T T T T A C A C T T A A，反向弓| 物：A C G A T T G T
G C A T C A G C T G A，荧光探针：5 '-TEXAS REDS 1(>-CCGTCTGCGGTKTGTGGAAA GGTTATGG-BHQ2-3,；粑标核衣壳蛋白（n u c l e oc aps id, N)正向引物：G G G G A A C T T C T C C T G C T A G A A T，反向引物：C A G A C A T T T T G C T C T C A A G C T G，荧光探针：5，-F A M-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQl-3,0扩增体系:C O V检测缓冲液D 13. 75 p U C O V 反应液6.25 y，总体积2(> ^1。设立系统对照：阳性 对照、阴性对照（3. 5 ^1 C O V阳性质控加1. 5 j u l内部质控)以及空白对照(只有P C R扩增体系，不加核 酸模板，来检查扩增反应是否存在交叉污染和环境 污染）。血浆样本核酸、阳性对照以及阴性对照各加 5 W作为模板，振荡混匀，短暂离心。
实时荧光定量P C R反应程序：5() °C 5 min逆 转录，95 °C 20 s 预变性，然后 95 °C 10 s，57 °C 60 s 45个循环，扩增信号由核酸检测系统采集。基线设 置取6〜15循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚 好超过阴性对照扩增曲线的最高点，可根据噪声情 况进行调整。
国际生物制品学杂志2(121年2月第44卷第1期 Int J Bio丨ogicals. February 2丨12丨.Vo丨•44. No. 1• 9•
结果判读：TEXAS RED61U和F A M通道，循 环阈值(c y c l e o f th r eshold，Ct)<37 判为阳性，无 Ct 或Ct>40为阴性,37 <Ct <40为可疑；Cy5通道，Ct <35判为阳性，无Ct或Ct >35则为阴性。
1.4核酸检测方法验证
根据《新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆实 验室检测质量控制要求》w进行。
1.4. 1专属性
1.4. 1. 1交叉实验向2019-n C o V已知阳性样本 (P())和已知阴性样本(NO)加入53种呼吸道感染相 关病原体（表1)核酸，确认该检测方法的专属性。按照病原体组号将混合阳性样本命名为P1-P18, 混合阴性样本命名为N1 -N18.提取核酸后进行 2019-nCoV核酸检测，P1—P18检测结果应均为阳 性，N1—N18检测结果应均为阴性。
表1专属性验证使用的53种呼吸道感染相关病原体
组号 病原体名称
1地方性人类冠状病毒H K U l、OC43、NIA3
2 地方性人类冠状病毒229E、SA R S冠状病毒、中东呼吸综
合征冠状病毒
3 E B病毒、甲型H1N1流感病毒(2(I(W)、季节性H1N1流感
病毒
4 H3N2,H7N9、H5N1 流感病毒
5 新生隐球菌、军团菌、百日咳杆菌
6 乙型流感病毒Yamagata、ViC t〇n a谱系，呼吸道合胞病毒A型
7 呼吸道合胞病毒B型，副流感病毒1、2型
8 副流感病毒3型，鼻病毒A、B组
9鼻病毒C组，腺病毒1、2型
10 腺病毒3、4、5型
11 腺病毒7、55型，肠道病毒A组
12 肠道病毒B、C、D组
13 人间质肺病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒
14 轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒
15 水痘-带状疱疹病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体
16 流感嗜血杆菌、金黄葡萄球菌、肺炎链球菌
17 化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝扦菌
1S 烟曲霉、白念珠菌、光滑念珠菌
1.4. 1.2干扰实验向P()和N(>加入27种干扰 物质(表2)，确认该检测方法的专属性。按照干扰 物质的编号将阳性样本命名为P I P27，阴性样本命名为N1—N27，提取核酸后进行2019-nCoV核酸 检测，PI—P27检测结果应均为阳性，N1— N27检 测结果应均为阴性。
1.5 LOD
采用3批1 x L O D〜2 X L()D浓度企业参考品 各检测2(>次，至少19次检测结果中基因
和/或N基因应为阳性。
1.6重复性
通过对2m9-nC〇V核酸检测试剂盒自带的阳 性对照及阴性对照的内部质控进行检测，确认该方 法在相
同检测条件下，连续多次检测所得阳性对照 及内部质控Ct之间的一致性符合要求。
要求：阳性对照C t的相对标准偏差（r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n，RSD)应<15%，内部质控 Ct 的R S D&<15%。
1.7精密度-中间精密度
确认该方法在相同检测条件下，不同检验人员、不同时间进行检测，连续多次检测所得阳性对照以 及内部质控Ct结果之间的一致性是否符合要求。阳性对照Ct的R S D应<20%，内部质控Ct的RSD 应 <2()%。
1.8性能确认
为评估该方法在本实验室能否适用于COVII> 19康复者恢复期血浆中2(>19-nC〇V核酸检测，采用 建立的方法在同一设备检测2(>份C O V H>19康复 者恢复期血浆样本。
1.9结果判读
根据2019-nCoV核酸检测试剂盒说明书及《新 型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆实验室检测质量 控制要求》[6]进行判读。
2结果
2.1专属性
2. 1. 1交叉实验对CC)V(I()1N检测结果显示，PI--P18检测结果均为阳性（表3)，N1—N18均为 阴性，系统对照符合要求：阳性对照检测结果为阳 性，阴性对照为阴性，空白对照为阴性。
2. 1.2干扰实验参考品COV(K>2N检测结果见表 4，阳性样本P1— P27检测结果均为阳性，阴性样本 N1—N27检测结果均为阴性，系统对照符合要求。2.2 LOD
检测参考品 COV(101N、a)V m2N及 COV()()3N 各2(>次，分别有19次CtRFlaA和iV基因至少1个为 阳性(表5)，符合要求，系统对照符合要求。
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表2专属性验证使用的27种干扰物质
干扰物质实验浓度干扰物质实验浓度干扰物质实验浓度
黏蛋白\%&布地奈德0. 64 mg/ml洛匹那韦200 mg/ml 血液(人类）\%&莫米松0. 05 % b利托那韦200 mg/
ml 苯福林10 mg/ml氟替卡松300 mg/ml莫匹罗星30 mg/ml 羟甲唑啉0. 5 mg/ml盐酸组胺  3 mg/ml妥布霉素  3 mg/ml
氯化钠(含防腐剂）〇.9%b a_干扰素  5 m lU/m l左氧氟沙星150 mg/ml 倍氯美松0. 25 mg/ml扎那米韦  3 mg/ml阿奇霉素300 mg/ml 地塞米松8 mg/ml利巴韦林1mg/ml头孢吡肟40 mg/ml 氟尼缩松0• 3 mg/ml奥司他韦12 mg/ml米诺环素70 mg/ml
曲安奈德  1. 1mg/ml帕拉米韦  3 mg/ml阿比朵尔70 mg/ml
注：》体积分数；*!质量分数
表3参考品COV001N交叉实验阳性样本的循环阈值
样本编号开放阅读框la/b核衣壳蛋白
PO27.6828.84
PI27. 1928.35
P226. 7928. 47
P326. 9228.34
P427.5128.67
P527. 1428.33
P627.2728.46
P726. 4026. 90
P827.2528. 48
P927. 2028.77
P1026. 4428. 35
P ll26. 1627. 93
PI 226. 7028.32
PI 327. 1328.72
PI 427. 2428. 56
PI 527. 4928. 91
P1627.3028. 87
PI 726. 8928. 90
P1826. 7028.69
2.3重复性
阳性对照N基因在F A M通道C t的R S D为0.2()%，Oi^Fld 基因在 TEXAS RED610 通道 Ct 的R S D为0.22%；内部质控在Cy5通道Ct的RSD 为1.9%，均<15%，见表6。系统对照符合要求。
表4参考品COV002N干扰实验阳性样本的
循环阈值
样本
编号
开放阅读
框la/b
核衣壳
蛋白
样本
编号
开放阅读
框la/b
核衣壳
蛋白P029.9328. 78P1430. 6028. 78
P129. 7428.73P1529.8328. 70
P229. 3528. 55P1629. 6628.65
P329. 4728.32P1729.7528. 80
P430. 2428. 83P1826. 7028. 69
P529. 8228.41P1930. 3528. 80
P629. 8828.78P2029.6228. 58
P729. 6028.79P2128.6927.84
P828. 4628. 55P2228.7228.34
P929.8828. 86P2328.3127.97
P1030. 3529. 00P2428. 5228.26
P ll28.3928. 15P2528.8228. 02
P1231. 7229. 25P2629. 2128.61
P1330. 1628. 88P2728.8328. 20
2.4中间精密度
实验员A和B检测结果显示，阳性对照/V基 因在F A M通道Ct的总体R S D为4. 13%，Oi?Fla6 基因在TEXAS RED610通道C t的总体R S D为 12.8%；内部质控在匚75通道（：1的总体1«0为
1.92%，均<20%，见表7。系统对照符合要求。
2.5性能确认
20份COVIEM9康复者恢复期血浆的2019- nCoV核酸均为阴性，同时系统对照符合要求，见 图1。
国际生物制品学杂志 2021 年 2 月第 44 卷第 1 期 Int J Biologicals，February2()2K Vol.44, No. 1• 11 •
表5 3批参考品检测限实验的循环阈值
CQV001N COV002N COV003N
〇N〇N()N 132. 5034. 0135. 5133.7431.0934. 68 232. 5034. 0232. 0633. 6832. 6433.46 332. 7033.9532.5233. 9133.3833.61 438. 8434. 1334.6434.4432. 9834.68 533. 0333. 9731.5834. 2931.793
4.75 632. 4433.9631.4333. 9430. 8834. 01 733. 7034. 80--31. 8233. 72 8--32. 0733. 9934. 1833. 49 <；32.8733.4532. 8233. 7631. 8033. 34 1033.2534.3932. 8233. 5532. 0533.93 1132. 0933.8132.2733.5132. 8034. 01 1232. 5033.6431.6133. 9232. 1433.93 1332.4533. 9834. 0834. 3932. 6433. 63 1433.3534.6833. 1434.55-36. 02 1532. 8534.6131.9935. 1331.9334. 08 1631.4733.4237.2536. 2232. 4033.36 1732.9733.4433.2831.6931. 5933. 79 1832. 5833.6831.5534. 1732.3933. 44 1932.9334. 5633. 2033. 9934. 5133. 15 2033. 3933.7432.9734.2832. 1633. %注:()：开放阅读框la/b; N：核衣壳蛋白;-：无
表6阳性对照及内部质控重复性试验的循环阈值样品1  2    3    4    5    6 RSD/%阳性对照
FAM 28.33 28.39 28.45 28.45 28.49 28.43 0.20 TR 26.06 26.20 26.15 26.21 26.19 26.12 0.22内部质控
Cy5 31.37 31.03 29.65 30.97 30.89 30.74    1.90注：R S D：相对标准偏差；TR: TEXASRED610
1.2
1.0
0.8
B0.6
鉍0.4
0.2
0.0
-0.2
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-
0.2
- —TEXAS RED610通道
- —FAM通道.一
- •一Cy5通道
i
i
i
-------
1>
1.2
1.0
0.8
_0.6
鉍0.4
0.2
0.0
-0.2
1.2
1.0
0.8
翅0.6
鉍0.4
0.2
0.0
-0.2
10 20
循环阈值
@
—TEXAS Rf:D610通道
…FAM通道
Cy5通道
3040
—^
y U im iir* ■-
1
1020
循环阈值
⑤
•— TEXASRED610 通道
…FAM通道
Cy5通道
3040
1020
循环阈值
©
—•TEXAS RED610通道
-•FAM通道
•…Cy5通道
3040
0 10 20 30 40
循环阈值
©
图1新型冠状病毒核酸检测PC R性能确认A阴性对照B 阳性对照C空白对照D新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆
表7阳性对照及内部质控中间精密度试验的循环阈值
样品
实验员A实验员B总RSD 123456RSD/%123456RSD/%/%
阳性对照
FAM28.3328. 3928.4528. 4528. 4928.430. 2030. 7430. 8230. 9230. 6630. 6830. 730. 32  4. 13 TR26. 0626. 2026. 1526.2126. 1926. 120. 2233. 7233.6132. 9133. 0233.6333.72  1. 1012. 80内部质控
Cy531.3731.0329. 6530. 9730. 8930. 74  1. 9031.5530. 2730. 4029. 7530. 5030. 29  1.95  1.92注：R S D：相对标准偏差；TR: TEXASRED610