拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化
刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅
【摘 要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene
was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector was transferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.
【期刊名称】《作物研究》
【年(卷),期】2018(032)002
【总页数】4页(P131-134)
【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化
【作 者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅
【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128
【正文语种】中 文
【中图分类】svg无损转化为pdfQ785
PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。由于其参与植物体内众多的防御反应，近年来一直受到广泛的关注和研究。目前人们已经从许多不同的植物中克隆出了该基因，如拟南芥、小麦、棉花等［5～7］。
在植物体内，PDF1.2基因主要功能是编码产生一类名为植物防御素的抗性蛋白。植物防御素不仅能抑制真菌的生长，同时也能在一定程度上抑制细菌的生长，抑制酶的活性，这些独特的生物学特性使得植物防御素能有效的帮助植物抵抗来自于各种不利条件如真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的侵害［8～10］。然而目前对于防御素提高植物抗性的作用机
制并不是很明确。因此，利用基因工程技术研究PDF1.2基因的表达模式对于了解防御素的作用机制具有十分重要的意义。
由于具有操作简单、反应快速、检测准确、技术成熟等优点，将目的基因的启动子与GUS基因融合并转化植物，对转基因植物进行GUS染，通过观察GUS蛋白在转基因植物中不同器官及组织的表达来研究目的基因的表达模式是基因工程常用的技术之一。如胡佳等人利用GUS基因作为显基因来研究拟南芥叶片中油体含量［11］；张鑫平等人利用GUS染技术来分析拟南芥和油菜花药的特异性表达［12］。因此，本试验中选择 GUS基因作为报告基因来构建PDF1.2基因启动子的重组载体。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col－0，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，根癌农杆菌 （Agro bacterium tumefactions） GV3101，载 体pCAMBIA1301等都由作物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题组提供。
1.2 植株培养条件
将拟南芥种子置于消毒液（20%bleach＋0.1%Triton100）中浸泡10～15 min，于超净工作台上用无菌水冲洗4～5遍，适当密度播撒在MS固体培养基上，4℃春化3 d，转入光照培养室22℃长日照（16 h光照／8 h黑暗）培养。长至7 d时，将其转入营养土（东北黑土与蛭石的体积比为1∶1）中，盖上透明塑料薄盖1～2 d。
1.3 载体的构建
在TAIR网上查询拟南芥PDF1.2基因并选取上游启动子区域序列，用在线软件Plantcare对其进行启动子元件分析。利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计1对扩增引物PDF1.2－F／PDF1.2－R，在引物5′端分别加上PstⅠ和NcoⅠ酶切位点，扩增引物序列为：
用SDS法提取拟南芥总DNA，以此为模板，用引物PDF1.2－F／PDF1.2－R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段并纯化。将回收纯化后的目的片段和pCAMBIA1301载体用PstⅠ和NcoⅠ限制性内切酶在37℃下过夜双酶切，将得到的目的片段和目的载体进行回收。用T4连接酶将PDF1.2基因启动子连接至pCAMBIA1301载体的预期位点。通过热激法将重组表达载体转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，正确的进行测序鉴定。
1.4 表达载体的遗传转化
挑选测序正确的重组质粒，通过电击法转化到根癌农杆菌GV3101中，将转化液置于含有卡那霉素（50 mg／L）、庆大霉素（100 mg／L）、利福平（50 mg／L）的YEB固体培养基上28℃黑暗过夜培养，挑取阳性菌进行扩大培养。采用浸花法转化拟南芥Col－0野生型。收获T0代种子播种于含有潮霉素（25 mg／L）的MS固体培养基上，长日照条件下培养2周后将抗性植株移栽至营养土中正常生长。
1.5 GUS染
GUS染液配制：将X－gluc溶于磷酸钠缓冲液中（含100 mmol／L pH 7.0的磷酸钠缓冲液，10 mmol／L EDTA，5 mmol／L铁，5 mmol／L亚铁），终浓度为 1 mmol／L。
挑选长日照条件下生长7 d的抗性植株浸入GUS染液中，37℃避光过夜。用不同浓度酒精脱，显微镜下观察染情况。
2 结果与分析
2.1 目的片段克隆
在Plantcare网站对PDF1.2基因起始密码子ATG上游约2000 bp左右的启动子序列进行分析，结果发现其中包含了大量核心启动子元件TATA－box、CAAT－box，进一步分析发现其还含有部分与生物胁迫相关的顺式调控原件。这一结果表明该段PDF1.2基因启动子序列能正常启动该基因的表达，且PDF1.2基因在植物的抗逆和抗病等方面起到重要作用。
以拟南芥野生型基因组DNA为模板，利用引物PDF1.2－F／PDF1.2－R进行扩增，并利用电泳检测扩增片段，结果如图1所示。所得扩增片段大小约2000 bp左右，与预期大小相符，且没有非特异性扩增条带。这一结果表明目的片段克隆成功，PCR产物可用于下一步实验。
图1 PDF1.2基因启动子PCR扩增结果Fig.1 PCR result of PDF1.2 promoterM为Marker（5K）；Line1为PDF1.2基因启动子片段；Line2为未加DNA模板的对照组。
2.2 重组表达载体构建
将扩增所得目的片段与带有报告基因GUS的pCAMBIA1301载体进行酶切并用T4连接酶连接，将pPDF1.2∶∶GUS重组表达载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α。下一步挑选阳性菌进
行菌落PCR来检测转化结果，如图2所示。2～5号样本中，转化成功的菌落成功的检测到目的片段，转化未成功样本无法检测到目的片段。进一步对检测成功的菌落样本进行PstⅠ和NcoⅠ双酶切验证。挑取检测正确菌落进行测序鉴定，通过序列比对保留目的片段大小正确、无移码突变现象、且连接处与预期位置相符的样本进行遗传转化。