EMRE在小鼠心肌缺血损伤中的作用及其相关机制的研究
刘峰舟;荆哲;刘明莉;张恩尉;宁江华;牟佼
【摘 要】目的:研究调节线粒体钙单向转运体活性所必须的蛋白(essential MCU regulator,EMRE)在小鼠心肌缺血损伤中发挥的作用及其相关机制.方法:利用心肌点注射EMRE腺病毒(Ad-EMRE)上调心肌组织的EMRE分子表达水平,对照小鼠心肌点注射增强绿荧光蛋白腺病毒(Ad-eGEP),48 h后,采用结扎小鼠左冠状动脉前降支方法建立心肌梗死(MI)模型.实验设置三组:假手术组(给予Ad-eGFP);心肌梗死对照组(给予Ad-eGFP);心肌梗死处理组(给予Ad-EMRE).三周后,利用小动物超声系统测定小鼠心脏功能;Western blot及免疫组化检测EMRE分子的表达;麦胚凝集素(WGA)染检测心肌细胞肥大程度;马松(MASSON)染检测心肌组织胶原含量;原位末端标记法(TUNEL)检测心肌组织的细胞凋亡;Western blot检测心肌组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的表达;MitoSOX荧光探针检测线粒体ROS水平.结果:与心肌梗死对照组相比,心肌梗死处理组的心功能明显变差,心肌肥厚明显加重,心肌组织胶原纤维含量更高.另外,心肌梗死处理组的心肌细胞凋亡明显增多,Caspase-3和Caspase-9表达明显升高,线粒体活性氧簇产生也明显增多.结论:EMRE过表达
可增加线粒体ROS生成,诱导心肌细胞凋亡,加重心肌缺血损伤.%To study the effect of essential MCU regulator (EMRE) on myocardial ischemia injury in experimental mice with underlining mechanism. Methods: Myocardial EMRE expression was up-regulated by EMRE adenovirus (Ad-EMRE) injection in mice myocardium tissue. Our research included in 3 groups: Sham operation group, sham mice received myocardium injection of eGFP adenovirus (Ad-eGFP); Myocardial infarction (MI) control group, the mice received Ad-eGFP injection and 48 hours later had coronary LAD ligation to establish MI model; MI treatment group, MI mice received Ad-EMRE injection. All animals were treated in 3 weeks. Mice cardiac function was examined by ultrasound; cardiomyocyte hypertrophy was evaluated by wheat germ agglutinin (WGA) staining, collagen fibrosis was measured by Masson staining, cell apoptosis was determined by TUNEL assay, protein expressions of EMRE, caspase-3 and caspase-9 were detected by Western blot analysis and mitochondrial reactive oxygen species (ROS) was assayed by MitoSOX fluorescence probe. Results: Compared with MI control group, MI treatment group showed the worse cardiac function, aggravated cardiac hypertrophy and elevated collagen fibrosis; in addition,
MI treatment group had obviously increased cardiomyocyte apoptosis and increased protein expressions of Caspase-3, Caspase-9 and more mitochondrial ROS production. Conclusion: Over expressed EMRE can increase mitochondrial ROS production, induce cardiomyocyte apoptosis and therefore, aggravate myocardial ischemia injury in experimental mice.
【期刊名称】《中国循环杂志》
【年(卷),期】2017(032)007
【总页数】6页(P701-706)
【关键词】线粒体转运蛋白质类;心肌缺血
【作 者】刘峰舟;荆哲;刘明莉;张恩尉;宁江华;牟佼
image pro plus【作者单位】710032 陕西省西安市,中国人民解放军第四军医大学第一附属医院 心血管内科;空军 94195 部队卫生队;710032 陕西省西安市,中国人民解放军第四军医大学第一附属医
院 心血管内科;解放军兰州总医院 心内科;宝鸡市第二中医医院 呼吸内分泌科;中国人民解放军第四军医大学唐都医院 骨科;空军 94195 部队卫生队;西安市中心医院
【正文语种】中 文
【中图分类】R54
目的：研究调节线粒体钙单向转运体活性所必须的蛋白（essential MCU regulator，EMRE）在小鼠心肌缺血损伤中发挥的作用及其相关机制。
方法：利用心肌点注射EMRE腺病毒（Ad-EMRE）上调心肌组织的EMRE分子表达水平，对照小鼠心肌点注射增强绿荧光蛋白腺病毒（Ad-eGEP），48 h后，采用结扎小鼠左冠状动脉前降支方法建立心肌梗死（MI）模型。实验设置三组：假手术组（给予Ad-eGFP）；心肌梗死对照组（给予Ad-eGFP）；心肌梗死处理组（给予Ad-EMRE）。三周后，利用小动物超声系统测定小鼠心脏功能；Western blot及免疫组化检测EMRE分子的表达；麦胚凝集素（WGA）染检测心肌细胞肥大程度；马松（MASSON）染检测心肌组织胶原含量；原位末端标记法（TUNEL）检测心肌组织的细胞凋亡；Western blot检测心肌组织半胱氨酸天
冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的表达；MitoSOX荧光探针检测线粒体ROS水平。
结果：与心肌梗死对照组相比，心肌梗死处理组的心功能明显变差,心肌肥厚明显加重,心肌组织胶原纤维含量更高。另外，心肌梗死处理组的心肌细胞凋亡明显增多，Caspase-3和Caspase-9表达明显升高，线粒体活性氧簇产生也明显增多。
结论：EMRE过表达可增加线粒体ROS生成，诱导心肌细胞凋亡，加重心肌缺血损伤。
心肌缺血损伤是心血管系统疾病的发病机制之一[1]，然而心肌缺血损伤的机制尚未阐明清楚。目前的研究表明，线粒体钙超载，线粒体损伤，细胞凋亡和坏死等在心肌缺血损伤的发生、发展过程中发挥着重要的作用[2,3]。调节线粒体钙单向转运体活性所必须的蛋白（essential MCU regulator，EMRE）位于线粒体内膜，单次跨膜蛋白，维持线粒体钙单向转运体（ mitochondrial calcium uniporter，MCU）的正常功能，参与线粒体钙稳态的调控[4,5]。目前，EMRE在心肌缺血损伤中的作用鲜有报道，为了明确EMRE在心肌缺血损伤中的作用，本研究拟在小鼠心肌点注射EMRE腺病毒（Ad-EMRE）上调EMRE表达的基础上，建立心肌梗死模型，以此来探讨EMRE在心肌缺血损伤中的作用及其相关机制，期望为临床
心肌缺血损伤的防治提供新的靶点和方向。
1.1 实验材料
8周龄雄性C57BL/6小鼠30只购自第四军医大学动物中心，微量注射器购自瑞士汉密尔顿公司，Ad-EMRE和Ad-增强绿荧光蛋白（eGFP）均为本实验室已有，EMRE抗体购自美国Santa cruz公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）和β-肌动蛋白（β-actin）抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自武汉三鹰公司，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）液购自美国Advansta公司，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）购自美国Invitrogen公司，蛋白定量、细胞总蛋白提取试剂盒，购自上海碧云天公司，麦胚凝集素（ wheat germ agglutinin，WGA）购自美国Sigma公司，原位末端标记法（TUNEL）凋亡检测试剂盒购自瑞士罗氏公司，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核标记染料购自美国Invitrogen公司，MitoSOX Red荧光探针购自美国Invitrogen公司，PBS缓冲液（pH=7.4；主要成分：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L， KH2PO42 mmol/L）实验室配制。
1.2 方法
实验分组及EMRE表达上调：将30只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为三组（每组10只）：假手术组（给予Ad-eGFP）；心肌梗死对照组（给予AdeGFP）；心肌梗死处理组（给予Ad-EMRE）。经小鼠左胸第4~5肋间暴露心脏，利用微量注射器在小鼠左心室心肌壁内分别注射Ad-EMRE和Ad-eGFP（30 μl），然后将心脏置回并排空胸腔气体，采用荷包法缝合伤口。48 h后，每组随机选取3只，提取心肌组织蛋白，蛋白免疫印迹（Western blot）法检测EMRE表达水平。
心肌梗死小鼠模型建立：小鼠心肌点注射Ad-EMRE 48 h后，在左胸同一位置暴露心脏，通过结扎左冠状动脉（冠脉）前降支建立心肌梗死模型，术后心电图显示心肌出现缺血，即确认心梗模型成功建立。
心功能检测：利用异氟烷麻醉小鼠，待其状态稳定后，采用加拿大Visual Sonics公司所产的Vevo 2100高分辨率小动物超声成像系统检测小鼠心功能变化，利用Vevo 2100系统分析软件进行数据的处理分析，测量小鼠左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。
心肌组织学分析：取小鼠心脏，用预冷的PBS缓冲液冲洗心脏，取冠脉结扎部位以下心肌组
织，用10%的福尔马林溶液固定48 h后，进行挂机，包埋，制作石蜡切片。冰冻切片则无需固定，用包埋剂处理新鲜心肌组织后，进行制片。麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）对小鼠心脏组织的冰冻切片进行染检测心肌细胞肥大情况，WGA可以特异性的标记心肌细胞膜，呈现红荧光，显示心肌细胞横截面的轮廓，共聚焦显微镜观察拍照，利用Image-Pro Plus 6软件进行数据分析计算心肌细胞的平均横截面积[6,7]。马松（MASSON）染检测心肌组织纤维化水平，光学显微镜下，每张切片随机选取六个视野进行观察拍照，Image-Pro Plus 6软件分析心肌组织胶原纤维容积分数，胶原纤维容积分数=胶原纤维面积/视野总面积。
TUNEL荧光标记法检测心肌细胞凋亡：按照试剂盒说明处理标本进行检测，DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合标记为蓝荧光，TUNEL可以特异性的将凋亡细胞中损伤断裂的基因组DNA标记为绿荧光，当心肌细胞核被同时标记为蓝和绿荧光时提示该心肌细胞发生了凋亡。
心肌组织蛋白提取及Western blot 法检测EMRE分子的表达：取左前降支结扎部位以下的心肌组织，预冷PBS缓冲液洗两遍，匀浆器匀浆，再次PBS缓冲液清洗一遍后，离心去上清，
加入裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解半小时，余步骤同细胞蛋白提取一致。随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，EMRE 抗体稀释比例为1∶500，Caspase-3 抗体稀释比例为 1∶1 000，Caspase-9 抗体稀释比例为 1∶800，β-actin 抗体稀释比例为 1∶3 000，采用ECL化学发光试剂盒进行检测。
心肌细胞线粒体活性氧簇（MitoROS）检 测：利 用 荧 光 探 针MitoSOX Red（Invitrogen）对小鼠心肌组织的石蜡切片进行染，检测心肌细胞线粒体的活性氧（ROS）水平。MitoSOX Red是一种特异性靶向线粒体的新型荧光染料。MitoSOX Red被超氧化物氧化，氧化之后可以与核酸结合发出红的荧光。因此，我们可以通过检测红荧光的强弱来反映线粒体ROS的水平。红荧光越强，提示MitoROS水平越高，MitoSOX Red（5μmol/L）室温避光孵育15min，PBS缓冲液洗片后，共聚焦显微镜拍照，并利用Image-Pro Plus 6软件进行荧光强度的分析和处理[8]。
统计学方法：采用SPSS16.0统计学软件进行数据处理。数据均以均数 ± 标准差（ ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ one-way ANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 上调EMRE对心肌梗死模型小鼠心脏功能的影响（图1）