2022年第32卷第1期
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地黄梓醇对中风后抑郁大鼠行为学影响及机制研究
王祥煜1，周霞2*，刘炬3，刘付红3，张佳乐1，孙立平1，李万斌2
1山东中医药大学，山东济南250014；
2山东中医药大学第二附属医院，山东济南250001；
3山东第一医科大学第一附属医院，山东济南250014
*通信作者：周霞，E-mail：****************
收稿日期：2021-08-05；接受日期：2021-11-20
基金项目：山东省自然科学基金面上项目（ZR2019MH128）
DOI：10.3724/SP.J.1329.2022.01007开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
摘要目的
目的：：探究地黄梓醇对中风后抑郁大鼠行为学的影响，并从行为学、外周血清及脑组织5-羟胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）及脑源性神经营养因子（BDNF）表达方面探讨其作用机制。方法
方法：：将24只SD大鼠按照随机数字表法分为模型组、梓醇干预组和假手术组，每组8只。除假手术组外，其余2组采用大脑中动脉线栓阻塞法（MCAO）联合慢性不可预见性温和应激法（CUMS）诱导抑郁样行为建立中风后抑郁大鼠模型，造模时间为7d。造模结束后分别于第1天、第4天、第7天采用旷场试验，高架十字迷宫测定评价大鼠的行为，TTC染检测脑梗死体积，ELISA试验检测血清及海马组织中5-HT、NE、BDNF水平。结果
结果：：梓醇干预组与模型组相比，在旷场试验中干预后第4天和第7天穿越格数、站立次数、移动总距离显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；高架十字迷宫测定，干预后第4天和第7天梓醇干预组进入开放臂次数的比例（OE%）、进入开放臂时间的比例（OT%）明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明地黄梓醇可以明显增加大鼠的自发活动，缓解抑郁症状。处理动物后取病变脑组织，经
TTC染显示，梓醇干预组脑梗死体积比模型组明显缩小（P＜0.05）。ELISA试验，与模型组比较，干预后第4天和第7天梓醇干预组血清5-HT、BDNF升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而干预后第4天、第7天梓醇干预组与模型组血清NE含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，梓醇干预组海马5-HT、BDNF明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而梓醇干预组与模型组海马NE含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明地黄梓醇可以提高中风后抑郁大鼠5-HT、BDNF水平，对NE改善并不明显。结论
结论：：地黄梓醇可改善中风后抑郁状态，促进神经功能恢复，调控中枢5-羟胺能系统功能与促进BDNF分泌是其可能作用机制。
关键词中风后抑郁；地黄梓醇；5-羟胺；去甲肾上腺素；脑源性神经营养因子
中风后抑郁，又称卒中后抑郁（post-stroke de⁃pression，PSD），是中风常见的并发症，指继发于中风病的以兴趣减退、情绪低落、自罪自责等情感障碍为主要临床表现的综合征［1］。一项针对中风患者的回顾性研究表明，PSD病患死亡率是非PSD患者的3～4倍［2］。有研究表明，其发生与5-羟胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素（norepineph⁃rine，NE）和脑源性神经营养因子（brain-derived neu⁃rotrophic factor，BDNF）含量的降低有关［3-4］。当单胺类神经递质与神经营养因子功能紊乱，尤其是情志调控的脑部区块如海马含量下降时，可能造成抑郁现象。生地黄是历代医家
中风病的常用组方用药之品，梓醇是其主要有效成分。本项目组在前期研究已证实梓醇具有促血管新生效应，调控血管内皮生长因子及其受体是其作用机制之一［5］。中风后抑郁是抑郁症的特别类型，其形成原因复杂，如
引用格式：王祥煜，周霞，刘炬，等.地黄梓醇对中风后抑郁大鼠行为学影响及机制研究［J］.康复学报，2022，32（1）：40-47.
WANG X Y，ZHOU X，LIU J，et al.Effect and mechanism of catalpol on behavior in rats with post-stroke depression［J］.Rehabilitation Medicine，2022，32（1）：40-47.
DOI：10.3724/SP.J.1329.2022.01007
王祥煜等：地黄梓醇对中风后抑郁大鼠行为学影响及机制研究
中枢神经器质性损伤导致的功能障碍、情志调控脑区的损伤、家庭与社会支持系统薄弱等。由于其系中风病的并发症之一，中枢神经器质性病变及因中风导致的各种功能障碍造成的“无力、无望、无助”感是其内在根本原因，社会家庭支持及个人信念系统是其外部原因。因此通过改善中枢神经系统功能及对特定脑区神经内分泌状态调控可帮助中风患者尽可能恢复缺损神经功能，改善心理情绪状态，而二者又可以相互影响，相互促进，从而帮助中风患者重建生活信心与自理能力，回归家庭和社会。除康复训练外，
具有神经血管单元保护、促进神经功能重塑且具心理情绪相关神经内分泌调控能力的药物或组分是本病的理想目标。基于此，本研究通过观察地黄梓醇干预后中风后抑郁大鼠行为学变化，并从脑组织形态学、中枢及外周血清5-HT、NE、BDNF的影响，探讨其作用机制，为临床提供参考。
1资料与方法
1.1研究对象
SPF级雄性SD大鼠24只，体质量（220±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［SCXK（鲁）2019-0003］。动物适应环境：温度21～25℃，日温差±1℃，湿度50%～70%，普通饲料喂养。
1.2实验药物
梓醇纯度≥98%，相对分子质量为362.33（上海源叶科技有限公司）。
1.3试剂与仪器
MCAO线栓（北京西浓科技有限公司），水合氯醛（阿拉丁C104202-500g）；ELISA试剂盒（美国R&D公司）；XR-XZ301型旷场试验箱、XR-XG201型高架十字迷宫（上海欣软信息科技有限公司）；SMART2.5视频行为学分析系统（西班牙Panlab公司）；2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride（TTC，Sigma公司，T8877-25G）。
1.4分组与干预处理
SD大鼠24只，采用随机数字表法分为模型组、梓醇干预组和假手术组，每组8只。除假手术组以外，其余2组大鼠以大脑中动脉线栓阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）［6］联合慢性不可预见性温和应激法（chronic unpredictable mild stress，CUMS）［7］诱导抑郁样行为建立PSD大鼠模型。①具体操作方法：术前12h禁食，10%水合氯醛（0.4mL/ 100g）腹腔注射麻醉后，将其用医用胶带仰卧位固
定于操作台上，颈部备皮，酒精棉球消毒。沿大鼠
锁骨正中做竖向切口，在手术显微镜下暴露右侧并
钝性剥离出颈总动脉（common carotid artery，CCA）、
颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉
（internal carotid artery，ICA）。结扎右侧CCA与ECA
的远心端，使用止血夹夹闭ICA。在距离CCA分叉3mm处的CCA上用眼科剪剪出一个长约0.3mm的小口，插入线栓，进入ICA，并向内深入大脑中动脉。
栓线插入完毕后，将预留的结扎线拉紧固定，清理
颈部血块，逐层缝合皮肤。整个试验过程中大鼠置
于37℃恒温台，注意保暖，待大鼠恢复清醒后放于
饲养箱，保持恒温、恒湿。在手术过程中死亡或处
死解剖后发现脑出血者剔除，重新选取大鼠造模，
补充到相应组中，保证每组动物数量。②造模成
功标准：大鼠苏醒后出现左侧前肢弯曲、肩内旋和
以对侧上肢为重的瘫痪，前进时向手术对侧转圈。
选用缺血造模成功的大鼠，手术后第1天开始每天
不同时间选取夹尾1min、禁水24h、禁食24h、束缚5min、昼夜颠倒24h、电击1min、4℃冰水游泳5min等7种刺激方法中的１种，交替应激大鼠，避免大鼠产生耐受性，共刺激7d。假手术组仅剥离出CCA、ICA和ECA，不插入线栓，不给予CUMS刺激。通过旷场试验评价造模是否成功。
1.5药物干预
梓醇干预组给予地黄梓醇9mg/kg，使用生理盐
水配制［8］。模型组给予等体积生理盐水。假手术组
不给予任何药物干预。于造模成功后24h内经腹
腔注射给药，每日1次，连续7d。
1.6行为学观察
1.6.1旷场试验于造模后第1天、第4天、第7天测
评。采用立柱体旷场试验箱，底边长和宽各100cm，
高40cm，周壁内面及底面均染为黑。将大鼠放
在试验箱底中心，使用SMART2.5实时视频行为学
分析系统观察大鼠3min内运动情况。试验布置在
暗室内，每次测定结束将大鼠尿液及粪便用酒精清
理干净并用干布擦干，再进行下1只大鼠的观察。
统计大鼠旷场方格穿越格数、站立次数、移动总距
离，以评估运动能力。
1.6.2高架十字迷宫测定于造模后第1天、第4天、
第7天测评。试验开始前将每只大鼠置于塑料盒子
中令其适应环境5min。任由大鼠自由探索5min后
快速放在高架十字迷宫的正中心区域，令头部正对
随机1个开放臂，释放后对进入开放臂的次数（OE）、
进入开放臂的时间（OT）、进入封闭臂的次数（CE）、
康复学报2022年第32卷第1期
进入封闭臂的时间（CT）4个指标进行测定。根据OE、OT、CE、CT计算进入开放臂次数的比例（OE%）与进入开放臂时间的比例（OT%）。每只测定5min。每次测试后，使用酒精清洁高架十字迷宫粪便、尿液等杂质残留以及去除异味，并用干布擦干。
1.7ELISA法检测血清5-HT、NE、BDNF含量
于造模后第1天、第4天、第7天早晨采集大鼠尾静脉血，标本置于抗凝塑料管内，混合离心后取血浆2mL于空白管内，低温保存待测。采用ELISA法检测血清中5-HT、NE、BDNF含量。操作严格遵循ELISA试剂盒说明进行。
1.8TTC染
麻醉大鼠后，取大鼠脑组织，放入-20℃冰箱冷冻30min。用磷酸盐缓冲盐溶液配置1%红四氮唑溶液（TTC，W/V），37℃水浴至TTC溶解，将脑组织按2mm厚度冠状切片，置于10mL TTC溶液中，37℃避光恒温孵育10min。每隔10min翻动脑片使其染均匀。正常脑组织TTC染后呈现红褐，缺血梗死区呈现苍白。经Image Pro Plus6.0专业图像分析软件处理、分析，计算大鼠脑梗死体积百分比。
1.9ELISA法检测海马5-HT、NE和BDNF含量
血清检测结束后，处理动物，取各组大鼠海马组织10mg，加入100μL匀浆液，安置于液态氮中反复冻融
3次，每次持续10min，再于冰浴中超声12s，然后3500r/min离心10min，取上清液，采用ELISA 法进行测定。
1.10统计学方法
采用SPSS22.0对数据进行处理。计量资料符合正态分布使用（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；重复测量资料比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1行为学结果
2.1.13组旷场试验结果比较见表1～3。
表13组旷场试验方格穿越格数比较（xˉ±s）
Table1Comparison of grid crossing number of open field test in three groups（xˉ±s）
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
65.38±13.62
13.13±4.731）
13.25±5.651）
F
交互=12.196
P
交互<0.001
第4天
66.13±10.26
13.50±8.371）3）
21.63±7.331）2）3）
F
时间=21.825
P
时间<0.001
第7天
68.88±12.43
13.63±5.321）3）4）
32.25±9.391）2）3）4）
F
组间=91.617
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.
表23组旷场试验站立次数比较（xˉ±s）
Table2Comparison of standing times of open field test in three groups（xˉ±s）
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
7.25±4.30
2.36±1.411）
2.13±1.961）
F
交互=1.314
P
交互<0.05
第4天
8.50±3.78
2.00±1.601）3）
3.88±1.731）2）3）
F
时间=4.603
P
时间<0.05
第7天
9.00±4.81
2.50±1.311）3）4）
5.13±1.811）2）3）4）
F
组间=13.001image pro plus
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.
王祥煜等：地黄梓醇对中风后抑郁大鼠行为学影响及机制研究
由表1～3显示，干预方法与时间在旷场试验结果上存在交互作用（P＜0.05）；干预方法与时间在旷场
试验结果上主效应显著（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组与梓醇干预组方格穿越格数、站立次数、移动总距离明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），说明造模成功，干预后仍存一定神经功能损伤；与模型组相比，干预后第4天、第7天梓醇干预组方格穿越格数、站立次数、移动总距离显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明地黄梓醇干预后大鼠活动量明显增加，缓解抑郁症状。
2.1.23组大鼠高架十字迷宫测定结果比较见表4和表5。
由表4和表5显示，干预方法与时间在高架十字迷宫测定结果上存在交互作用（P＜0.05）；干预方
法与时间在高架十字迷宫测定结果上主效应显著（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组与梓醇干预组
表33组旷场试验移动总距离比较（xˉ±s）cm Table3Comparison of total moving distance of open field test in three groups（xˉ±s）cm
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
663.70±91.77
227.00±45.711）
291.77±77.731）
F
交互=5.220
P
交互<0.05
第4天
652.03±89.75
248.45±58.701）3）
344.61±60.391）2）3）
F
时间=9.543
P
时间<0.05
第7天
662.68±86.94
264.35±65.631）3）4）
450.18±50.531）2）3）4）
F
组间=110.541
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.
表43组高架十字迷宫测定OE%比较（xˉ±s）% Table4Comparison of OE%of elevated plus maze measurement in three groups（xˉ±s）%
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
48.83±7.68
19.23±7.631）
18.05±7.901）
F
交互=5.817
P
交互<0.05
第4天
46.05±9.06
19.57±7.521）3）
27.87±7.721）2）3）
F
时间=5.921
P
时间<0.05
第7天
47.76±7.90
20.88±7.471）3）4）
33.70±5.721）2）3）4）
F
组间=42.825
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.
表53组高架十字迷宫测定OT%比较（xˉ±s）% Table5Comparison of OT%of elevated plus maze measurement in three groups（xˉ±s）%
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
49.01±10.73
20.74±6.701）
20.52±6.561）
F
交互=4.398
P
交互<0.05
第4天
50.94±7.77
19.90±8.781）3）
28.88±7.741）2）3）
F
时间=4.674
P
时间<0.05
第7天
49.03±7.90
20.93±7.801）3）4）
32.50±7.191）2）3）4）
F
组间=38.442
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.
康复学报2022年第32卷第1期
OE%、OT%显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），说明造模成功，干预后仍存在一定功能损害；与模型组相比，干预后第4天、第7天梓醇干预组OE%、OT%明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明干预后大鼠更愿意进入开放臂且停留更长时间，表明焦虑程度降低。
2.2外周及中枢5-HT、NE及BDNF表达
2.2.13组血清5-HT、NE及BDNF水平比较见表6～8。
由表6～8显示，干预方法与时间在5-HT、BDNF 结果上存在交互作用（P＜0.05）；干预方法与时间在5-HT、BDNF结果上主效应显著（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组与梓醇干预组5-HT、NE、BDNF显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）；与模型组相比，干预后第4天、第7天梓醇干预组5-HT、BDNF明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；干预后第4天、第7天梓醇干预组与模型组NE含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明地黄梓醇可以改善PSD大鼠外周血5-HT、BDNF含量。
2.2.23组海马组织5-HT、NE和BDNF水平比较见表9。
表63组血清5-HT水平比较（xˉ±s）ng/mL Table6Comparison of serum5-HT levels in three groups（xˉ±s）ng/mL
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
412.39±33.99
147.79±39.331）
143.53±26.361）
F
交互=39.267
P
交互<0.001
第4天
410.25±38.00
200.15±34.111）3）
294.11±22.281）2）3）
F
时间=94.150
P
时间<0.001
第7天
419.10±36.83
218.61±32.191）3）4）
367.28±20.391）2）3）4）
F
组间=176.656
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.
表73组血清NE水平比较（xˉ±s）ng/mL Table7Comparison of serum NE levels in three groups（xˉ±s）ng/mL
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
370.73±27.20
173.63±21.191）
174.02±24.261）
F
交互=0.162
P
交互>0.05
第4天
377.27±22.87
179.41±39.301）
173.55±24.791）
F
时间=0.749
P
时间>0.05
第7天
371.28±27.43
183.67±26.961）
180.76±28.581）
F
组间=370.797
P
组间<0.001
注：与同时期假手术组比较，1）P＜0.001。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001.
表83组血清BDNF水平比较（xˉ±s）ng/mL Table8Comparison of serum BDNF levels in three groups（xˉ±s）ng/mL
组别
假手术组模型组
梓醇干预组
F值
P值n
8
8
8
第1天
157.42±15.52
72.13±11.921）
70.48±11.621）
F
交互=8.219
P
交互<0.001
第4天
157.60±11.99
71.83±12.171）3）
86.34±10.181）2）3）
F
时间=4.498
P
时间<0.05
第7天
152.21±12.24
72.22±14.971）3）4）
91.60±11.371）2）3）4）
F
组间=133.523
P
组间<0.001
注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。
Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,
2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.