基金项目：辽宁省教育厅基金项目，项目编号:L2013332㊂
　作者简介：陈巍巍(1988)，男，辽宁岫岩人，主管护师，学士学位，主要研究方向为失眠症的基础和临床研究㊂　通讯作者：单伟(1979)，男，辽宁大连人，副教授，博士学位，主要研究方向为干细胞生物学特性研究㊂
枣仁安神胶囊对小鼠睡眠作用及其机制的实验研究
陈巍巍1，单伟2
(1.锦州医科大学附属第一医院重症医学科一病区;2.锦州医科大学基础医学院解剖学教研室，辽宁锦州121000)
  摘要：目的　探讨枣仁安神胶囊对小鼠睡眠的作用及机制㊂方法　昆明雄性小鼠，随机分为54组：空白对照组㊁枣仁安神胶囊低㊁中㊁高剂量组(0.19㊁0.38㊁0.76g /kg )，康斯顿阳性组(0.45g /kg )，连续30d ，灌胃给药㊂实验开始与结束，记录体重㊂采用协同钠㊁钠睡眠实验观察其对小鼠的催眠作用；小鼠脑组织中腺苷受体采用流式细胞仪和Western Blot 检测㊂结果　枣仁安神胶囊对小鼠体重增加没有影响，能延长钠诱导小鼠睡眠时间，提高钠阈下剂量小鼠入睡发生率，能减少钠睡眠潜伏期㊂使小鼠脑组织中腺苷A1受体(A1receptor ,A1R )和A2A 受体(A2A receptor ,A2AR )含量增加㊂结论　枣仁安神胶囊具有催眠作用，可能与增加A1R 和A2AR 的表达有关㊂
关键词：枣仁安神胶囊；催眠；失眠症;A1R ;A2AR
中图分类号:R285.5  　文献标志码:A  　文章编号:2096-305X (2020)06-0020-05
Effect of Zaoren Anshen Capsule on Sleep in Mice and Its Mechanism
Chen Weiwei 1,Shan Wei 2
(1.Ward 1,Department of Intensive Care Unit,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University;2.Department of Anatomy,School of Basic Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000China)
Abstract :Objective　To investigate the effect of Zaoren Anshen Capsule on the sleep in mice and its mechanism.Methods　
Male mice in Kunming were randomly divided into 54groups:blank control group,Zaoren Anshen Capsule groups of low,medium and high dose (0.19,0.38,0.76g /kg),and Conston positive group (0.45g /kg).The mice received intragastric administration for 30consecutive days.At the beginning and end of the experiment,their weight was recorded.The hypnotic effect on the mice was observed by the sleep experiment of synergetic pentobarbital sodium and barbiturate sodium.The adenosine r
eceptor in brain tissue of the mice was detected by flow cytometry and Western Blot.Results　Zaoren Anshen Capsule had no effect on the weight gain in the mice.It could prolong the sleep time of the mice induced by pentobarbital sodium,increase the incidence of sleep induced by sub⁃threshold dose of pentobarbital sodium,and reduce the sleep latency of barbitol sodium,which led to the increase of adenosine A1re⁃ceptor (A1R)and A2A receptor (A2AR)in brain tissue of the mice.Conclusion　Zaoren Anshen Capsule has hypnotic effect,
which may be related to the increased expression of A1R and A2AR.
Key words :Zaoren Anshen Capsule;hypnosis;insomnia;A1R;A2AR
  近年来，随着经济发展的快速增加，物质的日渐丰富，人们生活节奏也前所未有的加快㊂因此,
不同程度的焦虑等神经或精神症状也日渐增多㊂报道显示,10%~15%的成年人符合失眠症临床标准[1]㊂另外，失眠症造成的间接后果性损害(如工伤㊁病假等)明显大于直接损害(如失眠症所需费用等)[2]㊂因此，安全有效的镇静催眠药物一直是临床和基础研究者的研发热点之一㊂我国传统经典药物枣仁安神胶囊单独应用或者联合其他药物使用对失眠症患者㊁冠心病伴焦虑抑郁患者的临床效果较好[3-6]，但对该药的相关机制研究尚少
见㊂基于此，本组资料枣仁安神胶囊对小鼠镇静催眠作用和机制进行探讨，为该药的应用和机制提供理论依据，以期为失眠症提供新思路㊂1　实验材料1.1　药物
枣仁安神胶囊(贵州同济堂制药有限公司批
号131202)，阳性对照药(康斯顿广州万康保健品有限公司,20180311；钠(EXP:
20190221)㊁钠(EXP:20190311),sig⁃ma 公司㊂A1R 和A2AR 抗体,cy3标记二抗㊂02锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University
2020Dec.41(6)
1.2　动物
昆明种小鼠，雄性，体重18~22g㊂许可证号:SCXK(辽)2010-0001㊂
1.3　仪器
石蜡切片机(德国莱卡LEICA-RM2135)㊁流式细胞仪(美国BD公司FACS Calibur)㊁荧光化学发光凝胶成像系统(以列MF-ChemiBIS3.2)㊁光学显微镜(OLYMPUS,bx60日本)等㊂
2　实验方法
2.1　分组与给药
实验分4组：空白对照组㊁枣仁安神胶囊低㊁中㊁高剂量组(0.19㊁0.38㊁0.76g/kg)，康斯顿阳性组(0.45g/kg)，连续30d，灌胃给药，每10 g用药0.2mL㊂实验开始与结束，记录并分析体重㊂给药30d后，取肝脏㊁肾脏，常规石蜡切片，苏木素-伊红染(HE)㊂
2.2　直接睡眠实验
空白对照组给予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象㊂睡眠以翻正反射消失为指标，当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位㊂如超过30~60s不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠㊂翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录入睡动物数及睡眠时间㊂2.3　延长钠睡眠时间实验[7]
正式实验前先进行预实验，确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的钠剂量，用此剂量正式试验㊂在末次灌胃15min后，给各组动物按90mg/kg(依据预实验结果)ip钠(10mL/kg)，以小鼠翻正反射消失为睡眠指标，记录睡眠时间㊂
2.4　钠阈下剂量催眠实验
确定钠阈下催眠剂量40mg/kg，即80%~90%小鼠翻正反射不消失的钠最大阈下剂量㊂用此剂量进行正式实验㊂在末次给药15min后，给各组动物按40mg/kg(依据预实验结果)ip钠(10mL/kg)，以小鼠翻正反射消失达1min以上作为入睡判断标准，记录30 min内各组入睡动物数和睡眠发生率㊂
2.5　钠睡眠潜伏期[8]
确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的钠剂量230mg/kg，用此剂量正式试验㊂实验在末次灌胃15min后，给各组动物按230 mg/kg ip钠(10mL/kg)，以小鼠翻正反射消失为指标，观察睡眠潜伏期㊂
2.6　流式细胞仪检测小鼠脑组织中A1R和A2AR
末次给药30min后，取空白对照组㊁枣仁安神胶囊高剂量组小鼠脑组织，一半用于流式细胞仪检测，一半用于蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测㊂研磨为匀浆，用移液器反复吹散，过滤，离心，去除上清㊂按照说明书，按1∶100的比例稀释A1R和A2AR抗体，加入脑组织，洗涤，加入二抗，再次洗涤㊂上样流式细胞仪进行检测㊂Western Blot参考[9]，常规裂解㊁离心㊁变性㊁转模㊁孵育,β-actin为内参㊂
2.7　统计学方法
数据分析使用SPSS19.0统计软件包㊂计量资料均以均数±标准差(⎺x±s)表示,F检验及两两比较的SNK检验㊂P<0.05表示差异具有统计学意义㊂
3　结  果
3.1　形态学检测和体重的结果
枣仁安神胶囊及对照组动物在给予枣仁安神胶囊60min内，均未发生直接睡眠现象㊂给药期间小鼠腹泻㊁自主活动㊁皮毛等方面未见异常，肝脏㊁肾脏病理切片与空白组比较无异常，见图1㊂实验前，根据小鼠体重随机分组，实验结束时，各组小鼠的体重比较，差异不显著，即药物对小鼠的体重增长无影响，见表1㊂
表1摇枣仁安神胶囊对小鼠体重的影响(⎺x±s)
组别剂量(g/kg)n初始体重(g)实验结束时体重(g)空白对照组1220.975±1.49933.175±2.074枣仁安神胶囊组0.191221.642±1.05432.650±2.341枣仁安神胶囊组0.381221.592±1.24431.842±3.041枣仁安神胶囊组0.761221.733±1.20031.925±2.744 F值0.8660.621
P值0.4900.649
　注:P<0.01与空白对照组相比12
陈巍巍，等：枣仁安神胶囊对小鼠睡眠作用及其机制的实验研究
图1　肝脏和肾脏组织病理图(HE染)
3.2　延长钠睡眠时间的影响
与空白对照组比较，枣仁安神胶囊高剂量组睡眠发生率明显增加，差异显著㊂枣仁安神胶囊低㊁中剂量组㊁阳性组延长睡眠时间，但无统计学差异㊂表明枣仁安神胶囊能延长钠诱导小鼠睡眠时间，见表2㊂
3.3　钠睡眠潜伏期的影响
与空白对照组比较，枣仁安神胶囊高剂量组睡眠潜伏期明显减少㊂低㊁中剂量组降低睡眠潜伏期，但无统计学差异㊂表明枣仁安神胶囊能减少钠睡眠潜伏期，见表3㊂
3.4　小鼠脑组织中A1R和A2AR表达
流式和Western Blot检测显示：枣仁安神胶囊高剂量组与对照组比较,A1R和A2AR表达明显
22锦州医科大学学报　2020年12月,41(6)
增高，见图2㊂
表2　枣仁安神胶囊对钠诱导小鼠体重睡眠时间的影响(⎺x±s)
组别
剂量
(g/kg)n睡眠时间(min)
空白对照组1239.97±7.40枣仁安神胶囊组0.191245.89±7.77枣仁安神胶囊组0.381249.09±8.28枣仁安神胶囊组0.761253.38±17.10* F值2.287
P值0.072　注:*P<0.01与空白对照组相比
表3　枣仁安神胶囊对小鼠钠睡眠
潜伏期的影响(⎺x±s)
组别
剂量
(g/kg)n睡眠潜伏时间(min)空白对照组1223.167±4.668
枣仁安神胶囊组0.191221.417±7.922
枣仁安神胶囊组0.381219.333±7.596
枣仁安神胶囊组0.761214.183±5.488* F值3.164
P值0.210
　注:*P<0.05与空白对照组相比
AIR/β-actin和A2AR/β-acitin 蛋拍打上对表达量
A：流式细胞仪检测结果图;B㊁C:Western Blot的方法检测结果(*P<0.05与空白对照组相比)
图2　脑组织A1R和A2AR蛋白的表达
4　讨  论
失眠症指的是由于多种原因所引起的经常性睡眠减少，或者睡而易醒，醒后无法再次入睡，或者这不
容易入睡，睡眠时间缩短，甚至彻夜难眠的一种病证㊂枣仁安神胶囊由酸枣仁(炒)㊁丹参㊁五味子(醋炙)组成，功效重点在补阴㊁敛阴，即滋补肾水，收敛肝阴，调节肝肾功能，达到体内阴
32
陈巍巍，等：枣仁安神胶囊对小鼠睡眠作用及其机制的实验研究
阳平衡，养心安神的目的，可有效失眠症㊂本
研究首先考察了枣仁安神胶囊对实验小鼠体重的影
响㊂结果提示，受试药物对小鼠体重无影响，从体
重增长角度和病理实验证实该药物对生长情况没有
影响㊂给药期间，实验动物腹泻㊁自主活动㊁皮毛
等方面未见异常㊂实验结果初步表明了中药枣仁安
神胶囊对生长情况及器官脏器安全性㊂目前，很多
报道显示枣仁安神胶囊对失眠症患者临床效果良
好㊂本实验从入睡情况和睡眠时间上分别考察了枣
仁安神对睡眠的影响，结果显示枣仁安神胶囊具有
改善睡眠的作用㊂与临床实验结果一致[3]167-168㊂本文采用阳康斯顿牌改善睡眠胶囊作为对照,
主要成分酸枣仁提取物㊁远志提取物㊁牡蛎粉㊁茯
苓提取物㊁百合提取物㊁硬脂酸镁；保健功能：改
善睡眠；适宜人：睡眠状况不佳者㊂该药物主要
成分与我们受试药物相似，都含有酸枣仁，与受试
const的作用
药物都属于中成药，故选作阳物㊂关于睡眠实
验结果显示，该阳物在推荐剂量下对小鼠有作
用趋势，无显著性差异㊂可能的原因，我们推测可
能由于实验中采用的阳剂量对钠㊁巴
比妥钠干预下的睡眠作用影响不明显㊂
临床研究和基础实验对于枣仁安神的药效学研
究并不少见，但是对其作用机制研究尚不多见㊂本
研究采用流式细胞术和Western Blot检测脑内蛋白
的表达，对其改善睡眠的作用进一步探讨㊂腺苷是
一种内源性的促进睡眠的物质[10]㊂据报道，在长时间的觉醒过程中，大脑特定区域中腺苷酸的分泌增加，这对增加睡眠内稳态起着非常重要的作用[11]㊂文献报道显示腺苷和稳定的腺苷类似物证明可以诱导实验动物入睡[12]㊂腺苷在生理浓度，通过膜受体结合级联调节细胞功能㊂在中枢神经系统中表达的腺苷受体有四种亚型:A1R㊁A2AR㊁A2BR和A3R㊂其中,A1R和A2AR与睡眠调节相关[13]㊂近年来，对有关腺苷与镇静催眠关系以及与腺苷和腺苷受体相关的药物研究日渐深入，研制腺苷受体相关镇静物[14-16]㊂本实验结果显示枣仁安神胶囊高剂量组脑内A1R和A2AR表达增加，提示枣仁安神胶囊可能通过提高A1R和A2AR而发挥作用㊂关于枣仁安神胶囊通过何种信号通路对腺苷受体发挥的调节作用有待进一步研究㊂
综上所述，本研究通过动物实验探讨枣仁安神
胶囊的催眠作用及可能机制㊂结果显示，枣仁安神
胶囊无论在增加睡眠时间还是缩短入睡时间方面均
具有改善作用，并且可能与提高A1R和A2AR有关㊂
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收稿日期:2020-08-15
42锦州医科大学学报　2020年12月,41(6)