重庆医科大学
硕士学位论文
结核分支杆菌H37Rv与H37Ra的差异表达基因研究
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：呼吸病学
指导教师：***
20100501
结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ与Ｈ３７Ｒａ的差异表达基因研究
摘要
目的
构建结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ与Ｈ３７Ｒａ的差异表达基因消减文库，分离结核分支杆菌差异表达ｃＤＮＡ片段并分析其功能，筛选出致病株独有的保护性抗原编码基因，借助质粒载体将其表达于人类口腔非致病性黏膜共生菌戈登氏链球菌表面，为构建新型结核黏膜疫苗打下基础。本研究分为五部分：
１：结核分支杆菌培养
２：结核分支杆菌ＲＮＡ抽提及纯化
３：抑制性消减杂交
４：ｃＤＮＡ消减文库的构建
５：消减文库的扩增及鉴定及测序
方法
１：利用法国梅里埃公司ＢａｃＴＡＬＥＲＴＲＭＰ处理系统对结核分支杆菌强毒株Ｈ３７Ｒｖ和弱毒株Ｈ３７Ｒａ进行快速液体培养。
２：按Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒及ＴａＫａＲａ公司ＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ说明书操作进行结核分支杆菌ＲＮＡ抽提及纯化。
bacterium３：利用抑制性消减杂交技术分析结核分支杆菌强毒株Ｈ３７Ｒｖ和弱毒株Ｈ３７Ｒ的基因组ｍＲＮＡ的表达差异，并进行两轮消减杂交和两次ＰＣＲ。
４：将第二次ＰＣＲ产物与ｐＧＥＭ－Ｔ载体相连，电击转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５０ｔ，离心转化产物，取沉淀涂于蓝白斑筛选平板，构建正相和反相消减文库Ａ库和Ｂ库。
５：随机挑取Ａ库和Ｂ库白菌落作为ＲＴ．ＰＣＲ模版进行文库扩增和蓝白斑筛选，ＲＴ．ＰＣＲ鉴定差异表达文库。
６：随机挑选含有插入序列的阳性克隆送上海生ＴＮ序并进行序列分析。所得测序结果通过ＮＣＢＩ提供的Ｂｌａｓｔ软件与ＧｅｎＢａｎｋ收录的序列进行同源性比较，查阅文献，分析结果。
结果
以结核分支杆菌强毒株Ｈ３７Ｒｖ的ｃＤＮＡ为检测子的正相杂交和以弱毒株Ｈ３７Ｒａ的ｃＤＮＡ为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片断都得到选择性扩增，成功构建了差异表达ｃＤＮＡ文库Ａ库和Ｂ库。所长出的菌落中９０％为白克隆，其中Ａ库单一条带的克隆为７５％，Ｂ库为８０％，片断大小集中在１００．８００ｂｐ之间。分别从Ａ库和Ｂ库中各自筛选出一批克隆，送上海生工进行测序，正相杂交筛选到１１个特异性序列，反相杂交未筛选到特异性序列：其中１个为ＰＰＥ家族蛋白，１个编码已知的毒力因子ｍｃｅ蛋白，１个存在６０００早期分泌抗原（ＥＳＡＴ．６）的基因序列，１个编码膜蛋白，６个分别编码亮氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、短链还原酶、核糖核苷二磷酸还原酶、甲基分支菌酸合酶、异亮氨酰．ｔＲＮＡ合成酶，１个为可能蛋白。其中ＰＰＥ、ＥＳＡＴ．６为结核分支杆菌的保护性抗原。
结论
利用ＳＳＨ技术成功构建了结核分支杆菌强毒株Ｈ３７Ｒｖ和弱毒株Ｈ３７Ｒａ差异表达基因消减ｅＤＮＡ文库，并筛选到这两种菌株问的差异基因。ＳＳＨ用于比较强毒、弱毒微生物基因组间差异进而寻致病相关基因及特异性片段是可行的，具有可重复性。
关键词：分支杆菌，结核，抑制性消减杂交，ｅＤＮＡ文库
ＣｏＮＳＴＲＵＣＴＩｏＮｏＦＳＵＢＴＲＡＣＴＥＤＣＤＮＡＬＩＢＲＡＲＹＢＹＳＵＰＰＲＥＳＳＩＯＮＳＵＢＴＲＡＣＴＥＤＨ［ＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩｏＮ
ＦｏＲＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬＬＹＥＸＰＲＥＳＳＥＤＧＥＮＥＳＩＮ
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ＭⅣＣｏＢＡＣＴＥＲＩＵＭＴＵＢＥＲＣＵＬＯＳＩＳ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＴｏｓｃｒｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｂｅｔｗｅｅｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７ＲｖａｎｄＨ３７Ｒａ，ａｎａｌｙｚｅｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｗｏ
ｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｕｓｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ）ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｅｗｔｙｐｅｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｍｕｃｏｓａｖａｃｃｉｎｅ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｃｌｕｄｅｓｆｉｖｅｐａｒｔｓ：
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Ｐａｒｔ
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Ｍｅｔｈｏｄｓ