中国环境科学  2020,40(7)：2901~2908 China  Environmental  Science 基于碳源优化的反硝化除磷及微生物特性
潘婷1，张淼1*，范亚骏2，刘义忠3，庞晶津3，王一鑫1，於蒙1(1.扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州 225127；
2.扬州工业职业技术学院，江苏扬州 225127；
3.扬州市洁源排水有限公司，江苏扬州 225002)
摘要：接种厌氧/缺氧/好氧-生物接触氧化(AAO-BCO)系统的反硝化除磷污泥，采用厌氧/缺氧/好氧-序批式(AAO-SBR)系统，重点考察了乙酸盐和丙酸盐配比(1:0, 2:1, 1:1, 1:2和0:1)对反硝化除磷效率的影响，同时通过高通量测序对比了不同配比下微生物菌结构的变化.结果表明,5种工况下,AAO-SBR系统均具有较高的有机物去除和反硝化除磷能力.而当乙酸钠/丙酸钠=1:0时，厌氧阶段在高效利用COD(87.63%)的同时完成聚-β-羟基烷酸(PHAs)的合成(174mgCOD/gMLSS)，释磷量高达31.22mg/L；缺氧阶段PO43--P的去除(74%)伴随着NO3--N反硝化(90%),PHAs利用率为72.4%，实现了氮磷的高效去除.高通量测序结果表明：不同碳源配比影响了微生物菌的丰富度和多样性，其中变形菌门(Proteobacteria, 31%~76%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 1%~26%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 2%~31%)等占据绝大比例，而乙酸钠、丙酸钠共存时，微生物的多样性较好.当乙酸钠为单一碳源时，系统中聚磷菌(PAOs, 21.364%)
在与聚糖菌(GAOs, 2.317%)的竞争中占绝对优势.
关键词：AAO-SBR反应器；乙酸钠/丙酸钠；反硝化除磷；内碳源；高通量测序
中图分类号：X703      文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2020)07-2901-08
Denitrifying phosphorus removal and microbial characteristics based on the optimization of carbon sources. PAN Ting1, ZHANG Miao1*, FAN Ya-jun2, LIU Yi-zhong3, PANG Jing-jin3, WANG Yi-xin1, YU Meng1 (1.College of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2.Yangzhou Polytechnic Institute, Yangzhou 225127, China；
3.Yangzhou Jieyuan Drainage Company Limited, Yangzhou 225002, China). China Environmental Science, 2020,40(7)：2901~2908 Abstract：The effect of sodium acetate/sodium propionate ratios (1:0, 2:1, 1:1, 1:2 and 0:1) on denitrifying phosphorus removal was investigated using anaerobic/anoxic/oxic-sequencing batch reactor (AAO-SBR) by seeding the activated sludge from anaerobic/ anoxic/oxic-biological contact oxidation (AAO-BCO) system. The evolution of microbial community structure was also compared by high-throughput sequencing under different ratios. The results showed that the AAO-SBR system revealed high organic matter and denitrifying phosphorus removal abilities under five operating conditions. When the ratio of sodium acetate/sodium propionate
was 1:0, COD utilization efficiency was 87.63% while poly β-hydroxyalkanoate (PHAs) of 174mgCOD/gMLSS was synthesized simultaneously in the anaerobic stage, and phosphorus release was up to 31.22mg/L. In the anoxic stage, PO43--P (74%) was removed along with N O3--N denitrification (90%), and the utilization rate of PHAs was 72.4%, achieving efficient removals of nitrogen and phosphorus. High-throughput sequencing results showed that the abundance and diversity of microbial community were influenced by different carbon source ratios, among which Proteobacteria (31%~76%), Chloroflexi (1%~26%) and Bacteroidetes (2%~31%) occupied a large proportion. But the microbial diversity was higher when sodium acetate and sodium propionate were co-existed. Phosphate accumulating organisms (PAOs, 21.364%) were dominant with the competition of glycogen accumulating organisms (GAOs, 2.317%) using sodium acetate as the single carbon source.
Key words：AAO-SBR reactor；sodium acetate/sodium propionate ratios；denitrifying phosphorus removal；internal carbon source；high-throughput sequencing
水体富营养化是当今世界面临的最主要的水污染问题之一，其中氮磷含量是主要的控制因素，因此强化脱氮除磷效率是污水处理的重点和难点[1-2].然而，传统脱氮除磷工艺由于多种微生物对碳源的竞争，导致碳源成为低碳氮比(C/N)污水同步深度脱氮除磷的瓶颈[3].
反硝化除磷技术的提出使得生物除磷和内源反硝化同步进行，该技术利用反硝化聚磷菌(DPAOs)在厌氧/缺氧交替的环境下，以硝酸盐代替氧作为电子受体，通过“一碳两用”，同步实现脱氮和除磷[4]，尤其适用于低C/N污水.与传统生物脱氮除磷工艺相比，具有较高的氮磷去除效率，而且能有效节省碳源、曝气能耗，降低污泥产量[5].
收稿日期：2019-11-14
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51808482,51478410)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20170506)；江苏省高等学校大学生创新训练计划项目(201811117079X)；国家博士后科学基金资助面上项目(2018M632392)
* 责任作者, 讲师,**************
2902 中国环境科学 40卷
反硝化除磷工艺主要分为单污泥系统和双污泥系统.其中，双污泥系统(如Dephanox、A2N、A2O-BAF等工艺)相较于单污泥系统(如UCT、BCFS等工艺)对碳源的利用率更高，反硝化除磷效果更为显著[6].双污泥序批式(sequencing batch reactor, SBR)工艺是在传统生物脱氮除磷工艺基础上发展起来的，有效地解决了传统脱氮除磷过程中普遍存在的反硝化菌和聚磷菌的长短泥龄矛盾问题[7-8]，而且具有运行方式灵
活、节省费用和用地等优点.在影响反硝化除磷效率的众多因素中，碳源类型决定了聚磷菌的释磷能力和胞内贮存物的合成能力，也会影响污水处理系统中微生物的种结构[9].目前国内外对碳源类型的研究主要集中在乙酸钠、丙酸钠[10-11]，但是许多学者的研究结论却不尽相同.鲍林林等[12]在研究碳源类型对反硝化除磷的影响时发现，以丙酸钠为碳源的反硝化除磷系统的长期运行效果与以乙酸钠为碳源的系统差别不大.孙雅雯等[6]在考察碳源类型对厌氧/缺氧/好氧-生物接触氧化(anaerobic/anoxic/oxic-biological contact oxidation system, AAO-BCO)系统长期运行效果的影响中发现，当采用丙酸钠为外加碳源时, PO43--P 去除效果稳定高效，但氮的去除率较低；而以乙酸钠为外加碳源时，系统氮的平均去除率较高，但磷的平均去除率较低.可见，合适的乙酸钠/丙酸钠对系统的同步脱氮除磷效率及稳定运行具有重要的意义，而目前此方面的研究尚无定论.
鉴于上述分析，本研究接种长期稳定运行的双污泥AAO-BCO系统中的反硝化除磷污泥[13]，采用序批式AAO-SBR强化富集培养DPAOs，重点考察单因素——不同乙酸钠/丙酸钠对反硝化除磷的影响，结合内碳源聚-β-羟基烷酸(poly β-hydroxyalkanoate, PHAs)、糖原(glycogen, Gly)的转化利用情况阐释脱氮除磷机理，同时采用高通量测序分析微生物菌结构的演变规律，以期为低C/N比污水碳源的高效利用及外碳源投加提供理论依据，从而有利于实现污水的深度脱氮除磷及节能降耗.
1材料与方法
1.1接种污泥及实验用水
驯化接种污泥取自实验室连续流AAO-BCO 系统[13]，具有良好的反硝化除磷效果.接种污泥颜为黄褐，污泥沉降性良好，污泥体积指数(sludge volume index, SVI)在85~120mL/gMLSS左右，混合液悬浮固体浓度(mixed liquid suspended solids, MLSS)为4000mg/L左右.将种泥先进行24h的曝气恢复其活性，然后分别装入5个序批式AAO-SBR反应器中.
实验用水为人工配制的低C/N比模拟生活污水(C/N=4~5，见表1)，分为A液、营养元素和B液, A 液提供氮源(NaNO3)和磷源(KH2PO4),B液提供碳源；其中B1液为乙酸钠, B2液为丙酸钠，通过调控B1、B2液的投加比例，使得乙酸钠/丙酸钠=1:0、2:1、1:1、1:2和0:1(记为Run1~Run5)，控制进水COD为300mg/L左右.具体配水水质见表1.进水pH值在6.8~7.3之间，反应过程不调节pH值.
表1配水水质表
Table 1  Water quality
模拟生活污水基质名称/分子式浓度(mg/L)
KH2PO4  6 A液
NaNO340 B1液乙酸钠(CH3COONa) 0~300
B2液丙酸钠(CH3CH2COONa) 0~300
MgSO4·7H2O 0.45
FeCl3·6H2O    1.95
Na2MoO4  1.05
ZnSO4·2H2O 0.3
CuSO40.3
CoCl2·6H2O 0.3 微量元素
CaCl2·2H2O 0.3
1.2反应装置与运行方式
实验装置采用由有机玻璃制成的序批式AAO-SBR反应器，有效容积为10L.反应器内设有温度计进行温度监测，温度控制在(20±1)℃；底部配有磁力搅拌装置，厌氧阶段和缺氧阶段进行搅拌，使泥水均匀混合，转速为300r/min.好氧阶段以曝气砂头作为微孔曝气器，并以转子流量计调节曝气量，控制溶解氧(dissolved oxygen, DO)在2.0~3.0mg/L，用于吹脱氮同时吸收剩余的磷.
整个试验过程中, MLSS维持在3000mg/L左右.厌氧初始COD为300mg/L左右，搅拌2h，消耗有机物的同时进行释磷；厌氧反应结束后投加NaNO3溶液(初始NO3--N浓度为40mg/L)作为电子受体，缺氧搅拌4h 进行反硝化除磷；好氧曝气1.5h，静置及排水1h(排水比为75%)，其余时间闲置，工艺流程如图1所示.
7期潘婷等：基于碳源优化的反硝化除磷及微生物特性 2903
进水厌氧缺氧好氧沉淀排水、排泥
静置及排水1h
进水:5min 厌氧:2h
NO3--N
缺氧:4h好氧:1.5h
COD、PO43--P
图1  AAO-SBR反硝化除磷工艺流程
Fig.1 Schematic diagram of AAO-SBR denitrifying phosphorus removal process
1.3检测指标及分析方法
水样均经0.45μm中速滤纸过滤后检测.COD采
用兰州联华5B-1型快速消解仪测定; pH值采用雷
磁PHS-25型酸度计测定; DO采用HQ30D型哈希
便携式溶氧仪进行测定; NO2--N、NO3--N、PO43--P、
MLSS等常规指标测定参照标准方法[14]. AAO-SBR
系统运行60个周期后，考察内碳源PHAs和Gly的
转化利用特性，其中PHAs采用气相谱(Agilent
6890N)及DB-1型谱柱[15]检测; Gly采用蒽酮法
测定.稳定运行100周期后，采集5个反应器的泥样,
经预处理后，采用高通量测序平台PE300(美吉生物
医药科技有限公司，上海)进行微生物菌结构分析.
对于显著性水平分析采用统计产品与服务解决方
案(Statistical Product and Service Solutions, SPSS)
软件.
2结果与讨论
2.1厌氧条件下有机物利用特性
由图2可见，厌氧末COD浓度分别为37.62,
49.66,52.67,42.14,54.18mg/L，基本可以达到一级A
排放标准[16]，这一现象表明系统对乙酸钠和丙酸
钠都具有良好的利用特性. COD在厌氧段被大量
消耗，有机物的利用率均在80%以上，基本实现了
COD的高效利用，为后续缺氧状态下内源反硝化
除磷奠定了良好的基础.国内外研究表明[17-20]，乙
酸钠、丙酸钠作为污水中两种主要的碳源组分，易
被微生物作为营养物质吸收和转化.除单一的以
丙酸钠为碳源的系统(Run5)外，其他工况下系统
COD沿程变化规律较为一致，且5个不同工况下
系统对有机物的利用率虽然不完全相同，但是差
reactor的特点
值不大于5%，这表明不同乙酸钠/丙酸钠对COD
的利用效率影响较小，与郑楠等[21]、樊晓梅[10]结论
类似.
虽然5个工况总体差别不大，但从COD利用速
率的角度发现, Run5在反应前30min内, COD浓度
下降较慢，有机物利用率仅为17.03%，约为Run1~
Run4的1/2，剩余COD浓度高达270.9mg/L，但在
30min以后,Run5消耗有机物的速率明显提高，厌氧
结束时有机物利用率为83.41%，与Run1~Run4接近.
且当乙酸钠、丙酸钠共存时，系统对有机物的利用速
率高于以丙酸钠为单一碳源时的利用速率，说明乙
酸钠的存在对丙酸钠的利用速率具有促进作用，李
亚峰等[22]也得到了类似的结果，原因可能是丙酸钠
相较于乙酸钠而言，碳链较长，在厌氧反应前期自身
降解速率较慢.
0204060 80 100120
50
100
150
200
250
300
350
54.18
:83.33%~87.63%
270.9
Run5
C
O
D
浓
度
(
m
g
/
L
)
时间(min)
Run5
一级A排放标准
Run1~Run4:32.69%~39.05%
图2  不同工况下厌氧阶段COD的利用情况
Fig.2 Profiles of COD utilization in the anaerobic stage under
different operating conditions
2904 中  国  环  境  科  学 40卷
2.2  缺氧条件下的反硝化特性
缺氧条件下，反硝化过程中NO 3-
-N 浓度随时间的变化曲线如图3所示，可以根据曲线的斜率粗略判断反硝化速率的快慢.采用SPSS 进行数据分析，显著性P <0.01，均达到极其显著水平. 5个工况下，混合液的初始NO 3--N 浓度均为40mg/L 左右，随着反应的进行, NO 3--N 浓度不断下降，缺氧反应结束后，出水NO 3--N 浓度为4mg/L 左右，去除率超过90%.
另外，由图3可以看出，反硝化过程可以分为3个阶段：快速、慢速、稳定.总体上随着反应进行，反硝化速率逐渐降低.前90min (120~210min)，内碳源PHAs 充足,NO 3--N 浓度快速下降，曲线斜率最大，而5个工况之间差距不大(0.297~0.336, P <0.01)，意味着5个工况下反硝化速率都呈现最大值(5.57~
6.29mg/(gMLSS·h))，且不同乙酸钠/丙酸钠对该阶段影响较小；随后的60min (210~270min)，斜率减小且5个工况相差较大(0.093~0.163, P <0.01)，这是由于随着PHAs 的利用，反硝化速率降低(1.71~3.08mg/ (gMLSS·h))，约为第一阶段的28.13%~53.2%.可以看出，此时乙酸钠系统和丙酸钠系统
的反硝化速率呈现明显的差异性，且Run1斜率最大，推测单纯的乙酸钠系统厌氧段PHAs 合成量较高，在第二阶段时余量较多，有利于NO 3-
-N 的还原；最后的90min (270~ 360min), Run1~Run5斜率均接近为0(P <0.01)，此时PHAs 余量很少导致反硝化速率更低，几乎停止. PHAs 作为微生物代谢的限制性基质，其降解能力决定了反硝化动力, PHAs 含量与反硝化速率存在明显的相关性[23].然而，对于这种推断还需要从内碳源的角度进行深入分析.
120
180
240
300
360
10 15 20 25 30
35 40 45 120
180
240
300
360
120
180
240
300
360
120
180
240
300
360
120
180
240
300
360
NO 3--N
拟合直线
N O 3
--N (m g /L )
时间(min)
图3  不同工况下缺氧阶段NO 3-
-
N 变化
Fig.3  Variations of N O 3--N in the anoxic stage under different operating conditions
2.3  以乙酸钠为单一碳源时的反硝化除磷特性
通过上述研究发现，单纯的乙酸钠系统(Run1)有机物利用和反硝化情况较好.在运行60周期后，采用原位批次试验，重点考察以乙酸钠为单一碳源时的反硝化除磷特性.
2.3.1  厌氧段  由图4(a)可以看出，厌氧阶段, COD 浓度在120min 内从304mg/L 快速降为37.62mg/L,
可利用的外碳源基本消耗殆尽，与此同时伴随着磷酸盐的大量释放，厌氧结束时PO 43-
-P 浓度达到
39.02mg/L，而PHAs 与Gly 含量此消彼长, PHAs 的含量从76mgCOD/gMLSS 增加至250mgCOD/ gMLSS，消耗的外碳源几乎全部以PHAs 的形式储存在细胞体内，同时伴随着少量Gly 的分解(浓度从340mgCOD/gMLSS 降为290mgCOD/gMLSS)，为缺
7期潘婷等：基于碳源优化的反硝化除磷及微生物特性 2905 氧段反硝化吸磷创造了良好的条件.
厌氧释磷可分为2个阶段：前60min为快速释磷
阶段, PO43--P浓度由7.8mg/L快速升至31.91mg/L,
比释磷速率为10.83mg/(gMLSS·h), PHAs的合成量
为110.76mgCOD/gMLSS；后60min为慢速释磷阶段,
PO43--P仅增长了7.11mg/L，比释磷速率为1.79mg/
(gMLSS·h),PHAs的合成量仅有快速阶段的57.14%
(63.24mgCOD/gMLSS).表明厌氧60min后COD浓
度虽然一直在降低，但是PHAs的转化效率已经不高.
张建华等[24]在AAO-BCO中发现厌氧反应时间为
90min时, PHAs的合成量最大，释磷基本结束，厌氧
时间过长会导致PHAs的无效损失，直接影响反硝化
除磷作用.因此，为了避免PHAs的无效降解，厌氧反
应时间可以控制在90min.
0 30 60 90 120 150 180210 240 270 300 330 3600 5 10 15 20 25 30 35 40
45
N
O
3
--
N
(
m
g
/
L
)
时间(min)
-
P
O
4
3--
P
(
m
g
/
L
)
(a)乙酸钠：丙酸钠=1:0时PO43--P、NO3--N沿程变化及去除效果
0 30 60 90 120 150 180210 240 270 300 330 360390
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
P
H
A
、
G
L
Y
(
m
g
C
O
D
/
g
M
L
S
S
)
C
O
D
(
m
g
/
L
)
时间(min)
(b) 乙酸钠：丙酸钠=1:0时碳源转化情况
图4  以乙酸钠为单一碳源时的反硝化除磷特性
Fig.4 Denitrifying phosphorus removal characteristics with
sodium acetate as sole carbon source
2.3.2缺氧段和好氧段当投加电子受体NO3--N
后, PHAs被快速利用的同时出现了明显的同步脱
氮除磷现象.缺氧反应前120min(120~240min)内,
NO3--N浓度从40.20mg/L快速降低为5.12mg/L,
PHAs的消耗量为130mgCOD/gMLSS,Gly合成量为
45mgCOD/gMLSS, PO43--P浓度从39.02mg/L降为
12.60mg/L，吸磷速率为8.31mg/(gMLSS·h).随后的
30min, NO3--N浓度由5.12mg/L降为2.74mg/L，但在
最后的270~360min内基本不变, PHAs的消耗量仅
为51mgCOD/gMLSS, Gly合成量为10mgCOD/
gMLSS, PO43--P浓度从12.60mg/L降为9.80mg/L,
吸磷速率为0.75mg/(gMLSS·h).相关研究表明[25],
DPAOs的缺氧吸磷速率与NO3--N浓度呈现正相关
性，一定范围内NO3--N浓度越高吸磷速率越快.
好氧阶段，聚磷菌(Phosphate accumulating
organisms, PAOs)利用PHAs进行生长，吸收磷酸盐
并重新合成糖原，好氧反应结束后, PO43--P仅剩余
0.64mg/L，约有98.31%的磷酸盐被去除.可见短暂的
好氧阶段对于进一步降低和稳定出水PO43--P浓度
起着至关重要的作用.同时对比结果表明，在好氧条
件下, PO43--P浓度在90min内由39.02mg/L降为
0.64mg/L，而缺氧条件下以NO3--N为电子受体时,
反应结束(240min)后PO43--P浓度仍残留9.8mg/L.
上述两种情况下，好氧吸磷速率是缺氧吸磷速率的
3.5倍，换句话说PAOs在以O2作为电子受体时更加
活跃, PHAs的消耗量(200mgCOD/gMLSS)及Gly的
合成量(163mgCOD/gMLSS)也高于缺氧阶段.
综上所述，在以乙酸钠为单一碳源时, COD被
高效利用的同时伴随着PHAs和Gly的相互转化,
最终实现氮、磷同步高效去除.结果表明乙酸钠是一
种可以被DPAOs高效利用的理想碳源，这与Zhang
等[26-27]的研究结果相一致.
2.4微生物菌结构分析
2.4.1反应器内细菌落丰富度及多样性系统
稳定运行100周期后，通过16S rRNA基因高通量测
序技术对5个工况下不同反应器中的微生物落结
构进行分析.不同工况下, 5个样品的序列数在
32923~57737个，将优化序列在97%的相似性下聚类,
OTUs数在645~995个，其中覆盖度(coverage)均接近
100%，说明本次试验中污泥样本的测序结果可以代
表不同工况下反应器中菌的真实情况.
由表2可知, 5个不同工况下的污泥样本中