[收稿日期]㊀2021-03-30
[修回日期]㊀2021-04-28
[基金项目]㊀国家自然科学基金资助项目(91839107)
[作者简介]㊀薛可，博士研究生，研究方向为纤维化与心血管疾病,E-mail 为kex190637@163㊂通信作者王雯，教授，博士研究生导师，主要从事衰老相关心血管疾病研究,E-mail 为wangwen@ccmu.edu㊂
[文章编号]㊀1007-3949(2021)29-07-0553-07
㊃专家论坛㊃
蛋白质硝基化修饰在组织纤维化中的作用
薛可1，陈帅1，王英2，王雯1,3
(1.首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京市100069;2.中国航天科工集团七三一医院,
北京市100074;3.代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室，北京市100069
)
[专家简介]㊀王雯，教授，博士研究生导师,2004年毕业于中国协和医科大学，获得理学博士学位㊂2007 2008年在美国纽约州立大学布法罗分校做访问学者㊂现任代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室副主任，首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系副主任，中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会委员，北京生理科学会理事㊂主持国家自然科学基金项目5项，北京市自然科学基金重点项目1项㊁面上项目2项及多项省部级基金项目，以通信作者在Cardiovascular Research ㊁Free Radical Biology &Medicine 及Atherosclerosis 等期刊上发表学术论文60余篇㊂2008年获得教育部霍英东教育基金会第十一届高等院校青年教师奖,2012年入选北京市属高等学校青年拔尖人才培育计划㊂[关键词]㊀一氧化氮;㊀一氧化氮合酶;㊀硝基化;㊀纤维化
[摘㊀要]㊀应激是指机体在感受到各种因素的强烈刺激时，为满足其对应需求，内环境稳态发生的适应性变化与重建㊂氧化应激是活性氧(ROS )作为主要效应物参与的应激反应，通过氧化作用参与组织与细胞的适应及修复反应,ROS 在该过程中可以作为细胞信号转导的第二信使㊂参与氧化应激的自由基包括ROS 和活性氮(RNS )㊂而有RNS 参与的应激反应也可称为硝化应激，其具体表现为一氧化氮合酶(NOS )表达增加，一氧化氮(NO )生成增加，最终使RNS 水平升高，而RNS 的升高可使蛋白质发生硝基化修饰㊂应激表现为细胞的适应性反应以及组织的修复㊂纤维性修复是应激反应后期组织不完全修复的一种，是含有永久细胞的组织的主要修复方式，也是炎症反应后期组织对外界刺激的适应性反应，表现为
组织或器官的纤维化㊂本文就近期国内外关于蛋白质硝基化修饰在组织纤维化中的作用的研究进展进行综述㊂[中图分类号]㊀R363;R5
[文献标识码]㊀A
The role of protein nitration modification in tissue fibrosis
XUE Ke 1,CHEN Shuai 1,WANG Ying 2,WANG Wen 1,3
(1.Department of Physiology and Pathophysiology ,School of Basic Medical Sciences ,Capital Medical University ,Beijing
100069,China ;2.China Aerospace Science and Industry Corporation 731Hospital ,Beijing 100074,China ;3.Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Diseases Related to Metabolic Disorders ,Beijing 100069,China )[KEY WORDS ]㊀nitric oxide;㊀nitric oxide synthase;㊀nitration;㊀fibrosis
[ABSTRACT ]㊀Stress refers to the adaptive changes and reconstruction of the homeostasis of the body in order to meet the corresponding needs when the body feels the strong stimulation of various factors.㊀Oxidative stress is a stress response
involving reactive oxygen species (ROS)as the main effector.㊀Through oxidation,it participates in the adaptation and re-pair response of tissues and cells.㊀ROS can be used as the second messenger of cell signal transduction in this process.㊀
Free radicals involved in oxidative stress include ROS and reactive nitrogen species (RNS).㊀The stress response involving RNS can also be called nitrative stress,which is specifically manifested as increased expression of nitric oxide synthase (NOS),and increased expression of nitric oxide (NO),which ultimately leads to activity nitrogen levels increase,and the increase in reactive nitrogen can nitrate proteins.㊀Stress is manifested as the adaptive response of cells and the repair of tissues.㊀Fibrotic repair is a kind of incomplete repair of tissues in the late stage of stress response.㊀It is the main repair
method of tissues containing permanent cells.㊀It is also the adaptive response of tissues to external stimuli in the late stage of inflammatory response,which is manifested as fibrosis of tissues or organs.㊀This review summarized the recent progress on the relationship between protein nitration and fibrosis.
㊀㊀蛋白质翻译后修饰(protein post-translational modification,PTM)是调节蛋白质功能㊁增加蛋白质功
能多样性的重要方式㊂PTM主要包括磷酸化㊁糖基化㊁泛素化㊁硝基化㊁亚硝基化㊁甲基化㊁乙酰化㊁脂质化等㊂自20世纪90年代初以来，蛋白质硝基化被确立为一种氧化型翻译后修饰，并从生物化学和生物医学的角度得到了广泛研究㊂多种疾病的发生和发展可以概括成一系列炎症反应过程，例如动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)为渗出性炎症，慢性肝炎为增生性炎症㊂活性氮(reactive nitrogen species,RNS)是炎症反应的产物，而蛋白质硝基化的发生主要依靠RNS实现㊂随着研究进展，在不同的疾病动物模型和人类生理和病理条件下，被鉴定出的可以发生硝基化的蛋白数量不断增加㊂蛋白质硝基化主要发生在酪氨酸等芳香族氨基酸残基㊂蛋白质硝基化过程大致为一氧化氮自由基(㊃NO)经过一系列电子传递后生成二氧化氮自由基(㊃NO2),㊃NO2取代酚环第三位的氢进而使氨基酸发生硝基化修饰㊂㊃NO的生成是蛋白质发生硝基化的必要前提，而一氧化氮(nitric oxide,NO)是㊃NO 的主要来源㊂本文对NO的产生㊁功能㊁蛋白质硝基化的具体过程及其与相应疾病的关系进行了详细介绍㊂
1㊀NO的产生
NO是㊃NO的主要来源，主要通过一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)非依赖性和依赖性两种途径产生㊂NOS是促进氨基酸代谢的主要酶类之一，能够催化精氨酸至瓜氨酸的代谢反应㊂其催化反应底物为精氨酸㊁氧气(O2)㊁还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)，产物为瓜氨酸㊁NO 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP+)，在此过程中,NO的生成依赖O2㊂实验证明，血管紧张素Ⅱ(angiotensi
nⅡ, AngⅡ)长时间或短时间刺激均能够促进NO的生成增加[1]，但只有长时间AngⅡ刺激才能够促进NOS 增加[2]，提示存在不依赖NOS的NO生成方式㊂1.1㊀非NOS依赖途径
非NOS依赖生成NO途径中，在黄嘌呤氧化酶或具有亚硝酸盐或硝酸盐还原酶活性的蛋白质存在的情况下，硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)可以直接还原为NO[3]㊂研究初期实验证明，在早期灌注前和灌注期间短暂暴露于近红外线可保护心肌不发生梗死[4]，提示存在一种光敏性物质能够促进血管扩张㊂随着研究的进展，这种物质的产物被定义为内皮源性舒张因子(endothelium-derived rela-xing factor,EDRF)，随后,EDRF被证明是NO㊂而NO在当时被认为主要由NOS催化而来㊂在接下来的实验中，研究者证明，在缺氧条件下，近红外线的心脏保护作用能够被NO抑制剂完全逆转却只能被NOS抑制剂部分逆转[5-6]，提示在缺氧条件下,NO 的产生不依赖NOS㊂随后研究人员发现，在缺氧条件下产生的大部分NO来自于体内多种具有亚硝酸盐还原酶活性的生物化学物质，包括血红蛋白㊁肌红蛋白㊁珠蛋白㊁细胞素C等[7]㊂这些蛋白中，具有光敏性蛋白细胞素C，在近红外线照射后,NO 释放,NO结合鸟苷酸的位点，具有促进血管舒张作用，证明光暴露下的由NO引起的血管舒张不受NOS影响[8]㊂而珠蛋白在缺氧条件下能够还原硝酸盐至NO依赖其亚硝酸盐酶的还原性[9]㊂1.2㊀NOS依赖途径
NOS为体内合成NO的主要酶类，属加氧酶类㊂一般认为,NOS是一种二聚体，但这种二聚体没有催化活性；因此，严格来说，具有活性的NOS通常为四聚体，包括两个NOS和两个钙调蛋白[10]㊂辅酶包括四氢生物蝶呤㊁血红素黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)㊁黄素单核苷酸(flavin mono
nucleotide,FMN)等，催化O2㊁NADPH 以及精氨酸合成NO㊁瓜氨酸和NADP+㊂NOS具有三种异构体，分别为神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)㊁诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)，这三种异构体基因序列具有51%~57%的同源性㊂一般认为nNOS和eNOS具有钙依赖性，但iNOS没有钙依赖性㊂①nNOS，即NOS1，在神经元组织中首次被发现;②iNOS，即NOS2，普遍表达在各种细胞和组织中㊂值得注意的是，在心肌细胞中,NOS2的作用可能为钙依赖性[11];③eNOS，即NOS3，在血管内皮细胞中被首次发现，生理情况下reactive oxygen species (ros)
能够维持血管的紧张度及抑制血小板聚集；与其他的NOS不同，它可以定位于细胞膜[12]㊂三种NOS 中以NOS2的催化活性最强㊂热休克蛋白(heat shock protein,HSP)㊁陷窝蛋白(caveolin)㊁动力蛋白(dynamin)能够对NOS活性进行调节㊂NOS与caveolin耦联后被激活，发挥作用，因此caveolin可以作为调节NOS活性的重要物质㊂
在NOS诱导的NO产生中，有学者认为NOS的直接产物并不是NO，而是RNS，包括硝酰基阴离子(NO-)㊁过氧亚硝基阴离子(ONOO-)㊁亚硝基硫醇(s-nitrosothiol,SNO)及其相应质子化产物㊂尽管在NOS作用后的细胞中检测到NO，但在产物中也检测到超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD), SOD能够将含氮的活性物质催化为NO，因此认为NO是RNS经SOD催化后的二级产物[13]㊂同样持此观点的还有Schmidt等[14]，他们认为只有在加入SOD后由NOS催化而来的RNS才能形成NO㊂
2㊀NO的功能
根据其不同的存在形式NO的作用大致可分为两种㊂作为气体,NO能够通过扩散的形式进入细胞，或与细胞表面受体结合进而调节细胞功能㊂NO 的另一种存在形式为㊃NO，在一系列电子传递过程中转变为㊃NO2，最终使蛋白质发生硝基化进而影响蛋白质的功能㊂
作为气体形式存在的NO对血管的调节分为血管依赖性和非血管依赖性两种㊂血管依赖性即为NO舒张血管㊁调节血管张力㊁影响血栓形成㊁促进血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖以及促进血管细胞间连接[15]㊂在大小动脉中,AngⅡ能够通过促进NOS3的合成进而促进NO的分泌㊂而NO能够通过负反馈的作用减弱AngⅡ引起的血管收缩[16]㊂在AngⅡ诱导的成纤维细胞增殖的效应中,NO也能够对抗这种作用[17]㊂NO的非血管依赖性作用体现在其对兴奋-收缩耦联以及突触后神经递质传导的调节㊂NO对兴奋收缩耦联的调节表现为其对肌浆网Ca2+通道的影响[18-19]，对突触后神经递质传导的调节作用体现为NO本身可以作为神经递质参与神经信号的转导[20]㊂因此,NO具体发挥的作用还依赖其浓度,NOS以及不同的细胞类型㊂
NO的另一种存在形式为㊃NO，是蛋白质发生硝基化时㊃NO2的主要供体，整个过程有赖于超氧阴离子自由基(O2㊃-)的参与，其作用为提供电子，从而使㊃NO通过一系列电子传递过程形成㊃NO2[21-22]，进而使蛋白质发生硝基化㊂
3㊀硝基化
蛋白质的硝基化主要发生在酪氨酸(tyrosine, Tyr)等芳香族氨基酸残基㊂蛋白质硝基化可以引起蛋白质结构和功能的变化，表现为蛋白原有功能的丧失或者获得新的功能[23]㊂硝基化的具体效应取决于其修饰的蛋白[24-25]，因此，需对硝基化进行更加深入地研究以明确其在不同病理生理学过程中的作用和意义㊂蛋白质酪氨酸残基的硝基化反应是由酚环上3号位置的硝基取代一个氢，生成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)㊂蛋白质酪氨酸硝基化是一种自由基介导的途径，需要两种自由基，一种是酪氨酸自由基(㊃Tyr)，另一种为NO2-㊂在CO3-㊁NO2-㊁氧化基自由基(LOO㊃)和烷氧基自由基(LO㊃)的作用下，酪氨酸苯环2号位脱氢形成㊃Tyr[26]㊂而NO2-的形成则依赖NO的一系列电子传递过程㊂蛋白质的硝基化具有高度选择性㊂通常，只有1/10000~6/10000的酪氨酸残基能够发生硝基化㊂能够发生硝基化的蛋白质多为含有大量酪氨酸的蛋白质㊁线粒体与细胞骨架蛋白[27]㊁靠近产生活性氧和氮的位点的蛋白质㊂但是酪氨酸数量与硝基化与否并无较强相关性㊂随着计算机技术的发展，通过建模㊁序列分析等方式以及先进的算法能够预测，与非硝基化酪氨酸相比，硝基化的酪氨酸定位于含有α-螺旋结构(特别是赖氨酸和谷氨酸)的周围㊂在空间结构中，环状结构的酪氨酸更容易被硝基化，而在线性结构中的不易被硝基化㊂与带正电荷的氨基酸相比，带负电荷的更容易被硝基化[28-29]㊂
蛋白质的硝基化主要通过ONOO-依赖和非ONOO-依赖两种途径，其差别在于㊃NO转化为㊃NO2的过程中是否依赖ONOO-㊂
3.1㊀ONOO-依赖途径
过氧亚硝基是ONOO-和过氧亚硝酸(ONOOH)的总称，但在一般情况下，过氧亚硝基也指代ONOO-㊂由氧化㊃NO和O2㊃-合成㊂ONOO-依赖的蛋白质硝基化大致可以概括为：在精氨酸代谢成为瓜氨酸的过程中生成的㊃NO与O2㊃-形成ONOO-, ONOO-转化为㊃NO2，随后使酪氨酸硝基化(图1)㊂在ONOO-依赖途径中,㊃Tyr有两种命运，其中一种是在ONOO-存在的条件下,NO2-与㊃Tyr直接反应
生成3-NT；另一种是在NO -和O 2㊃-诱导下形成3-NT，而NO -的形成需要ONOO -的参与[30]
㊂
图1.ONOO -依赖途径
Figure 1.ONOO --dependent pathway
3.2㊀非ONOO -依赖途径
另外一条通路为酶依赖性，关键酶为髓过氧化
物酶(myeloperoxide,MPO)，在NO -和过氧化氢(hy-drogen peroxide,H 2O 2)存在的情况形成硝酰氯(nitryl chloride,NO 2Cl)和NO 2-
，进而促进酪氨酸硝基化[31-32](图2)㊂这种方式主要为炎症反应阶段发生在中性粒细胞中的蛋白质硝基化[33]㊂细胞素C 是一种生物过程中的电子传递体，通过非ONOO -依赖的方式发生硝基化[34]㊂同样通过MPO 途径发
生硝基化的蛋白质还有含血红素的蛋白质㊂除了上述酪氨酸硝基化的主要途径外，科学家发现㊃NO 也能够直接使酪氨酸残基发生硝基化,㊃NO 直接取代苯环第三位氢后发生两次电子传递，最终形成3-NT
[35]
㊂此外，红细胞内的氧合血红
蛋白(oxyhemoglobin,HbO 2)和其他蛋白的硝基化机制也与上述机制不同㊂它能够通过NO 2-
与酪氨酸残基的直接作用进而使酪氨酸残基发生硝基化㊂
一百多年前，人们就已经知道NO 2-很容易通过复杂的自催化过程将HbO 2氧化为高铁血红蛋白(hemi-globin,metHb)，产生各种各样的活性中间体，如㊃NO 2㊁H 2O 2和氧铁酰(oxo-ferryl)等㊂这些物质可
以介导HbO 2和其他几种红细胞蛋白酪氨酸残基的氧化和硝基化㊂考虑到正常的人类血浆低浓度微摩尔的NO 2-，而红细胞平均寿命是120天，通过这样的方式产生的硝基化酪氨酸含量极低，但其可能代表了另一个导致酪氨酸残基硝基化的重要途径[36]
㊂
图2.非ONOO -依赖途径
Figure 2.ONOO --independent pathway
4㊀硝基化与磷酸化的关系
纤维化是一种疾病终末期器官及组织的病理表现，特征为胶原蛋白的异常分泌与沉积，而在调节胶原分
泌的信号通路中，大部分通路依靠蛋白激酶使信号通路中的蛋白磷酸化从而激活通路进而引起胶原蛋白分泌增多㊂同时，纤维化也是一种慢性炎症，在该过程中㊃NO 增多，发生硝基化的蛋白质增多，那么在纤维化中，发生磷酸化的蛋白是否会发生硝基化，以及发生了硝基化的蛋白功能是否受影响，即蛋白质的磷酸化与硝基化之间的关系如何?目前认为，酪氨酸残基的硝基化作用阻碍了特定酪氨酸激酶的磷酸化，理论依据为针对Tyr 和硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NO 2-Tyr)的物理化学结构分析[33]㊂但在在体水平和细胞水平还尚未明确㊂有研究表明，硝基化对于磷酸化的影响取决于ONOO -的浓度，但随后的研究发现，血红蛋白SRC 家族中不存在浓度依赖性现象[37-38]㊂根据结构和功能的不同，大部分蛋白质或肽链能够被分为多个结构域，这些结构域承担不同的生物学功能，例如蛋白-
蛋白间的结合㊁蛋白-核酸间结合以及蛋白活性中心的暴露等，因此推测，硝基化与磷酸化之间的相互作用可能还依赖其磷酸化以及硝基化位点所在的蛋白结构域㊂
5㊀硝基化与纤维化疾病的关系
纤维性修复是不完全修复的一种，表现为组织或器官的纤维化㊂上文中提到，在不同细胞中，由
NOS催化生成的以及由NO2-或NO3-还原而来的NO转化为㊃NO后，通过一系列电子传递过程使蛋白质发生硝基化进而调节多种生物学功能㊂在不同的纤维化疾病中，均发现3-NT水平升高，提示NO㊁NOS可能通过影响蛋白质的硝基化过程而发挥相应的作用㊂在实际应用中，由于技术的限制，无法对RNS水
平进行直接检测，但根据硝化应激时的电子传递过程以及最终效应,3-NT水平的升高能够体现蛋白质已经发生硝基化㊂
5.1㊀衰老
在一项利用FBN大鼠衰老心室组织的研究中，研究者利用质谱的方式分析了衰老后蛋白的变化情况㊂结果显示，随着年龄的增加，蛋白的表达差异为渐进性，但24月龄鼠蛋白质硝基化水平突然升高[39]㊂24月龄鼠为老年鼠，各器官组织功能明显下降，尤其以心脏功能下降最为明显，但硝基化水平的突然升高与机体功能下降是否存在直接关系还有待进一步研究㊂
5.2㊀炎症性肺疾病
呼出气体检测作为一种无创性的检测手段，被广泛应用于临床㊂慢性阻塞性肺疾病(chronic ob-structive pulmonary disease,COPD)作为一种常见的炎症性肺疾病，具体表现为在长期刺激下气道上皮细胞出现慢性炎症反应，肺泡损伤，肺间质纤维化㊂研究证明，呼出气体检测中NO的增多可能与气道上皮中NOS2激活有关㊂在COPD加重期，嗜酸性粒细胞中NOS2升高，提示蛋白质的硝基化在慢性缺氧过程中可能发挥重要作用；另外，在肺特发性纤维化中，中性粒细胞和巨噬细胞中NOS2表达升高；在结核病中，肺泡巨噬细胞中NOS2表达升高[40-41]㊂提示在炎症性肺疾病中NOS2表达的改变可能通过影响蛋白质硝基化进而影响纤维化的进展㊂
5.3㊀心肌纤维化相关疾病
研究证明，在多种非缺血性心脏病的心肌组织中，均检测到了3-NT的升高，包括糖尿病性心脏病㊁肺动脉高压等[42-43]㊂人类和动物研究均表明，由ROS和RNS分别介导的氧化应激和硝化应激是影响糖尿病心脏重构和功能异常的因素㊂糖尿病引起的心肌重构包括心肌纤维化㊁心肌肥大以及不同程度的心肌细胞坏死㊂除了检测到3-NT升高外，研究发现，在糖尿病性心脏病中，硝基化肌浆网Ca2+-ATP酶2(sarco endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA2)与心肌纤维化呈正相关，而SERCA2的上调能够减轻非缺血性心脏病引起的纤维化㊂SERCA2是一种定位于心肌肌浆网的Ca2+-ATP酶，能够促进肌浆网钙离子内流[44]㊂金属硫蛋白(met-allothionein,MT)是一种能够抑制蛋白质硝基化的化合物㊂在一些实验中，加入MT之后能够改变3-NT的表达情况以及纤维化指标的表达情况[45-46]，提示蛋白质的硝基化能够影响糖尿病引起的心肌纤维化过程㊂在糖尿病引起的视网膜病变中，硝基化抑制剂可用于延缓糖尿病视网膜病变和微血管并发症的辅助[47]㊂因此，运用基于蛋白质硝基化的理论进行还需进一步深入研究㊂肺动脉高压是一种肺动脉压持续㊁缓慢升高的疾病，由于血管阻力增加，回流至右心房的血液无法通过右心室进入肺循环，其最终结局表现为右心室扩张，右心室纤维化㊂研究人员在尸检的肺标本中检测到3-NT升高[48]，提示在肺动脉高压中，硝化应激水平增高，蛋白质发生硝基化㊂肺动脉高压为慢性缺氧过程，其作用加强了由内皮细胞提供的NOS3与caveolin的解耦联，从而使蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)活性下降㊂研究证明,PKG能够抑制心力衰竭的过程[49]㊂在肺动脉高压中,NOS3表达升
高, NO含量增多，随后NO2-升高,NO2-能够促进蛋白质发生硝基化，因此推测，是PKG的硝基化使其活性下降，最终效应表现为心力衰竭㊂
缺血性心脏病主要包括冠状动脉粥样硬化㊁心绞痛㊁心肌梗死等，而这些过程可以概括为机体在受到缺血缺氧刺激后的一系列炎症反应，而炎症反应往往伴随3-NT的升高㊂但还未有研究证明在这些疾病中是否有3-NT水平的升高以及疾病相关蛋白的硝基化㊂
5.4㊀肝纤维化
肝组织具有较强的自我修复能力㊂在急性肝损伤中，坏死的肝细胞能够通过完全再生的方式进行修复，而在病毒性肝炎㊁酒精肝㊁脂肪肝㊁自身免疫性疾病等疾病中，由于刺激因子长期存在，使肝脏出现纤维化㊂在多种慢性刺激因子包括四氯化