细菌氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细菌氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒是一种旨在通过透膜荧光染剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细菌氧化条件下，产生荧光，来定量检测细菌活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种实验用细菌菌株氧化应激活性氧的分析。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。
技术背景
细菌作为模式生物，是环境化学毒性研究的常用工具。活性氧的检测可以用于诸如多环芳烃化合物或重金属的毒性作用以及修复（remediation）的评价指标。超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过
氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定细菌活性氧族的浓度。
产品内容
清理液（Reagent A）                                  毫升
染液（Reagent B）                                  微升
稀释液（Reagent C）                                  毫升
溶解液（Reagent D）                                  毫升
产品说明书                                              1份
保存方式
保存染液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于染的容器
微型台式离心机：用于样品操作
培养箱或恒温水槽：用于染孵育
200微升1厘米光径比皿或黑96孔板：用于荧光定量分析
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析
实验步骤
一、 直接测定
1． 准备好1毫升新鲜的待测菌液（OD600＝0.5；1 X 108细胞/毫升）
2． 移取200微升到1.5毫升离心管
3． 加入xx微升染液（Reagent B），混匀
4． 转移到200微升1厘米光径比皿或黑96孔板
5． 放进37℃荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（激发波长490nm，散发波长530nm）：每隔5分钟测读一次，持续120分钟――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
6． 构建活性氧和时间关系曲线reactive oxygen species (ros)
二、 培养上清测定
1． 准备好1毫升新鲜的待测菌液（OD600＝0.5；1 X 108细胞/毫升）
2． 移入到1.5毫升离心管
3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心移取200微升上清液到1.5毫升离心管
5． 加入xx微升染液（Reagent B），混匀
6． 放进37℃培养箱里或恒温水槽孵育30至60分钟，避免光照
7． 转移到200微升1厘米光径比皿或黑96孔板
8． 放进37℃荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（激发波长490nm，散发波长530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
三、细菌内测定
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移
出xx微升染液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染工作液，置入冰槽里。然后进行下列操作。
1． 准备好1毫升新鲜的待测菌液（OD600＝0.5；1 X 108细胞/毫升）
2． 移入到1.5毫升离心管
3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
4． 小心抽掉上清液
5． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
6． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
7． 小心抽掉上清液
8． 重复实验步骤5至7一次
9． 加入xx微升含有染液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染工作液，混匀
10． 放进37℃培养箱里或恒温水槽孵育30分钟，避免光照
11． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
12． 小心抽掉上清液
13． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
14． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
15． 小心抽掉上清液
16． 加入xx微升预冷的清理液（Reagent A），混匀
17． 加入xx微升溶解液（Reagent D）
18． 上下倾倒混匀数次
19． 转移到200微升1厘米光径比皿或黑96孔板
20． 放进37℃荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（激发波长490nm，散发波长530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
21． 或每隔5分钟测读一次，持续30分钟――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高
22． 构建活性氧和时间关系曲线
注意事项
1． 本产品为50次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 操作时，避免污染母液
4． 建议染完成后，即刻进行荧光检测分析
5． 孵育时，必须避免光照
6． 本产品染剂不易洗掉，染持久
7． 本公司提供阳性对照甲萘醌溶液（12041），观察细胞荧光增强现象
8． 本公司同时提供细菌细胞内活性氧初级荧光测定试剂盒（10016.14），满足不同用户需求
9． 本公司提供系列活性氧分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定荧光清晰