2017年第36卷第7期          CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS
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化    工    进
展
磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制动力学
邓杨敏，李冰麟，董文博，杨开利，张小里，赵彬侠
（西北大学化工学院，陕西 西安 710069）
摘要：对磷脂酶D （phospholipase D ，PLD ）在有机溶媒-水两相体系中催化磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine ，PC ）和乙醇胺（ethanolamine ，EA ）合成磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine ，PE ）的反应条件进行优化，并对反应动力学机制进行了研究。确定最佳反应条件为：温度28℃，pH 5.5，底物摩尔比（EA/PC ）20∶1，在此条件下PE 产率达87.2%。通过研究底物浓度对反应速率的影响，确定反应符合单底物抑制的Ping-Pang 机制。分别以Matlab 软件的Fminsearch 函数与Lineweaver-Burk 双倒数作图法求取动力学参数，结果基本一致，底物乙醇胺EA 的抑制常数为K iB =1.50mmol/L 。抑制机理为两分子EA 同时结合到一分子磷脂酰基-PLD 中间体上，生成磷脂酰基-PLD-(EA)2死端复合物，符合竞争性抑制反应动力学规律。该动力学模型预测与实验数据吻合良好，对PLD 催化合成PE 反应过程的操作及反应器选型设计具有指导作用。 关键词：磷脂酰乙醇胺；磷脂酶D ；磷脂酰基转移反应；动力学；底物抑制效应
中图分类号：TQ033      文献标志码：A      文章编号：1000–6613（2017）07–2601–06 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613. 2016-2298
Synthesis of phosphatidylethanolamine by enzymatic catalysis and its
substrate inhibition kinetics
DENG Yangmin ，LI Binglin ，DONG Wenbo ,YANG Kaili ，ZHANG Xiaoli ，ZHAO Binxia
（College of Chemical Engeering ，Northwest University ，Xi’an 710069，Shaanxi ，China ）
Abstract ：Phosphatidylethanolamine （PE ）was synthesized by phospholipase D （PLD ）catalyzed transphosphatidylation from phosphatidylcholine （PC ）and ethanolamine （EA ）in bi-phasic system. The conditions of enzyme-catalyzed reaction were investigated ，and the optimum conditions were as follows ：reaction temperature 28℃，pH 5.5，and the mole ratio of EA to PC 20∶1. The highest yield of PE can reach 87.2%. In addition ，the kinetic study indicated that phospholipids were catalyzed by PLD in a Ping-Pang manner. The kinetic model of PLD-catalyzed reaction considering the substrate inhibition was built ，which based on the Ping-Pang Bi-Bi mechanism. The parameters of kinetic model were determined by unconstrained nonlinear regression of the Fminsearch function in Matlab software. It showed that the results from this method were identical with that from the double reciprocal Lineweaver-Burk plot ，the inhibition constant for substrate EA was K iB =1.50mmol/L. Inhibition mechanism is a phosphatidyl-enzyme complex associating with two nucleophile molecules EA to form phosphatidyl-PLD-(EA)2 dead-end complex ，and the inhibition mechanism complied with the competitive inhibition of enzyme by EA during the transphosphatidylation reaction. The simulation results were well fitted to the experimental data for diff
erent conditions. Therefore ，it is speculated that this model supports the hypothesis described above and can provide guidance for the phospholipid synthesis
应工程。联系人：张小里，教授，博士生导师，研究方向为生物催化过程。E-mail ：*************** 。
收稿日期：2016-12-13；修改稿日期：2017-01-20。
基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2014JM2057）。 第一作者：邓杨敏（1994—），女，硕士研究生，研究方向为催化反
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process and design of the devices.
Key words: phosphatidylethanolamine；phospholipase D；transphosphatidylation；kinetics；substrate inhibition
磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）又称脑磷脂，是神经细胞膜的重要组成部分，对提高记忆力与增强大脑功能，减缓神经衰弱、动脉粥样硬化、肝硬化和脂肪性病变等具有显著功效，在食品
、药品等领域具有重要用途[1-2]。与传统萃取法和化学合成法相比，酶催化转化法具有条件温和、反应速率快、选择性高、副产物少的特点，是合成高纯磷脂的理想途径[3-5]。
磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是具有催化甘油磷脂分子磷酸二酯键水解活性的酶类，而一些特殊来源的PLD具有能催化含羟基化合物受体与磷脂酰基结合形成新磷脂的能力，可用于催化自然界中广泛存在的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）极性端基交换合成稀有磷脂[6-7]。国内外学者广泛关注PLD催化的磷脂酰基转移反应。BRUZIK等[8]提出磷脂酰基转移反应的两步S N-2机理，形成共价键相连的磷脂酰基-酶中间体，符合乒乓动力学机制；为了增加磷脂酰基转移反应相对于水解反应的竞争，通常合成新磷脂在高羟基底物浓度下进行。PLD催化合成PE的反应原理如图1所示，研究表明，PE合成中增大底物乙醇胺（ethanolamine，EA）浓度，PE产率先增大后减小，呈底物抑制特征[5]。研究该抑制反应动力学规律，确定反应动力学模型及动力学常数，对反应条件优化、反应器设计和放大都具有重要的参考价值。
本文采用溶媒-水两相体系制备PE、PC溶于有机相，PLD和EA溶于水相。在探讨温度、pH和底物组成等反应条件影响基础上，针对底物EA抑制效应，建立单底物抑制乒乓动力学模型，分别以Matlab软件的非线性回归功能与Lineweaver-Burk 双倒数作图法估算动力学参数，对比发现软件求解方法简便快速且结果可靠。最后进行验证实验，将实验结果与模型预测值进行对比，检验模型的准确性。
1  实验部分
1.1  仪器与试剂
恒温摇床（KYC100B），上海福玛实验设备有限公司；分析天平（T-114），北京赛多利斯仪器系统有限公司；智能扫描仪（Pro 800），佳能电器有限公司；薄层展开缸（PQ），上海信仪仪器有限公司。磷脂酶D，由本实验室保存的链霉菌发酵制备[9]；乙醇胺，天津市富宇精细化工有限公司；大豆卵磷脂（PC含量90%），北京美亚斯磷脂技术有限公司；PC、PE标品，美国Sigma公司；其他试剂均为市购分析纯。
1.2  实验方法
1.2.1  磷脂酰乙醇胺合成
76mg卵磷脂溶于20mL有机溶媒乙醚（PC浓度5mmol/L），EA溶于9mL水相（0.2mol/L乙酸缓冲溶液）。二者混合后加入1mL PLD（比活力8.88U/mg-蛋白质），置于200r/min恒温摇床反应，一定时间间隔取样进行薄层谱法分析。温度分别设定为20～36℃；反应初始pH分别取4.5～7.5；EA浓度分别取25～250mmol/L，对应底物摩尔比为（EA/PC）在(5～50)∶1。
1.2.2  酶促反应动力学
以1.2.1节所确定的最佳反应温度、pH条件进行磷脂酰基转移反应，分别在2～10mmol/L和20～150mmo
l/L范围内改变底物PC和EA的浓度，测定底物PC及产物PE浓度随时间的变化关系，确定一定底物浓度下的初始反应速率。
1.2.3酶促反应动力学模型验证
以1.2.1节所确定的最佳反应温度、pH条件进行磷脂酰基转移反应，取EA浓度为25mmol/L
和图1  磷脂酶D催化合成磷脂酰乙醇胺反应原理
第7期邓杨敏等：磷脂酰乙醇胺的酶促合成及底物抑制动力学·2603·
125 mmol/L，在5～25mmol/L范围内改变底物PC 浓度，分别测定对应底物浓度下的初始反应速率，与模型数据进行比较。
1.3酶促反应动力学参数估计
将1.2.2节所取得的反应速率与底物PC、EA 浓度实验数据，用单底物抑制乒乓机制动力学模型进行模拟，分别以Lineweaver-Burk双倒数法和Matlab软件优化法[10]求取动力学参数。其中双倒数法是求取酶促反应动力学参数的常用方法，成熟、直观；Matlab法采用优化算法函数Fminsearch进行无约束非线性回归，简便、快捷；两组结果进行对照，确定模型参数。
1.4  磷脂分析方法
磷脂样品以薄层谱法进行检测分析，GF254硅胶制成薄层板，0.5mm×100mm毛细管点样，采用氯仿∶甲醇∶水∶浓氨水=13∶5∶0.5∶0.25 （体积比）的展开剂展开，完成后取出晾干，碘蒸气染。染后用扫描仪扫描，用Photoshop和Gel-Pro软件处理分析，获得斑点灰度值，计算出各种磷脂浓度。
磷脂酰甘油产率定义为：（生成磷脂酰甘油的摩尔量/初始磷脂酰胆碱的摩尔量）×100%。
2  结果与讨论
2.1  温度对PE生成的影响
一般地，在酶稳定温度范围内，升高温度可加快反应速率，缩短反应时间；但当温度超过酶耐受范围时，
升温亦加快酶的失活速率，催化反应速率甚至减慢。温度对PLD催化合成PE的影响如图2所示，当温度低于28℃时，随着温度的升高，反应速率即PE产率随之增大；而温度超过28℃时，表示反应速率的PE产率反而降低。说明PLD在28℃
图2  温度对PE生成的影响
[5mmol/L PC，75mmol/L EA，0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.0）] 以上发生较为显著的构型改变，导致酶活性降低。28℃为磷脂酰基转移反应的最佳温度，PE最大产率达78.7%。
2.2  pH对PE生成的影响
pH影响PLD活性中心组氨酸残基中咪唑基团的解离程度，同时也影响底物的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化[8]。一般酶适用的pH范围在4～8，不宜过高也不宜过低。pH影响PLD催化合成PE实验结果示于图3，由图可见，当pH为4.5～5.5时，PE产率随酸度减小而增大；但酸度进一步减小，PE产率则持续下降，尤其当介质呈弱碱性时，产率最低，这是由于碱性条件下，咪唑基几乎不解离，酶活性显著降低。因此最佳pH 为5.5，此时PE产率达83.86%。
图3  pH对PE生成的影响
（5mmol/L PC，75mmol/L EA，0.2mol/L乙酸缓冲溶液，28℃）
2.3  底物摩尔比对PE生成的影响
底物摩尔比（EA/PC）对磷脂酰基转移反应的影响如图4所示。为避免水解反应，本研究体系均保持EA过量。由图4可知，在一定范围内PE产率随EA比例的增加而增大，但当EA比例增大到一定程度时，产率反而随EA比例的增加而降低。
图4  底物摩尔比对PE生成的影响
[5mmol/L PC，0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.5），28℃]
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当EA与PC的摩尔比为20:1时，PE产率达最大值87.2%，之后随底物摩尔比增大，PE产率则显著下降。推测可能是由于过量EA存在时，导致两分子亲核底物同时结合到一分子磷脂酰基-PLD中间体上，形成磷脂酰基-PLD-(EA)2死端复合物，从而表现出对反应的抑制效应。因此，EA和PC最优摩尔比为20∶1。
3  动力学方程
3.1  酶催化动力学实验
预实验表明，摇床转速在180r/min以上时，搅拌充分，可忽略扩散作用，本实验以转速200r/min 进行反应，因此表观速率可用来描述本征动力学规律。固定EA的浓度，测定不同PC浓度下的初始磷脂酰基转移反应速率，反应速率和底物浓度的双倒数图如图5所示：随着EA浓度的增加，直线的斜率逐渐增加，在1/v轴上的截距减小，说明此时动力学行为符合单底物抑制的乒乓机制，这个抑制即为乙醇胺抑制。
图5  底物浓度与反应速率关系
[0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH 5.5），28℃]
3.2  酶催化动力学模型
序列研究表明，链霉菌来源PLD具有高度相似的一级结构，酶分子含有的两个HxKxxxxD模体参与活性中心构成，其中，H表示组氨酸，K表示赖氨酸，D表示天冬氨酸[11]。酶催化反应过程如图6所示。
过程简要描述为：①酶N端结构域中组氨酸残基的咪唑基亲核进攻磷原子，与磷脂底物形成一个负电荷五价磷的过渡状态，C端结构域组氨酸残基质子化，给离去基团提供一个氢原子，释放出胆碱；
②C端结构域组氨酸与底物醇作用去质子化，活化醇作为第二亲核体亲核进攻磷脂酰基-PLD中间体
图6  酶催化磷脂酰基转移反应机制（DAG表示甘油二酯）
上的磷原子；③生成产物，同时PLD恢复到最初状态，并继续参与到下一轮反应中[12]，符合乒乓机制。
结合3.1节中的结果，猜测过量EA存在时可能导致两分子亲核底物同时结合到一分子磷脂酰基-PLD中间体上，形成磷脂酰基-PLD-(EA)2死端复合物，故在乒乓机制的基础上引入单底物EA抑制常数k iB进行处理，动力学方程如式(1)所示。
max A B
B
A B A B B A
iB
(1)
v C C
v
C
C C K C K C
k
=
+++
(1)
式中，v为反应速率；v max为最大反应速率；
C A和C B分别表示PC和EA的浓度；K mA和K mB分别为PC和EA的结合常数；k iB为EA的抑制常数。待求动力学参数包括v max、K mA、K mB和k iB。
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3.3  动力学模型求解 求解动力学模型参数的传统方法为双倒数法，本文利用Lineweaver-Burk 双倒数法，将式(1)两边取倒数，整理为式(2)。
A A
B B max A max iB A max B
11
1[1K K K C v v C v K C v C =+++    (2)
令 A B B max A max
A max i
B A
111
[1]K K y x A B v
C v C v K C v K C ==
=+==
，，，，
式(2)整理为式(3)。
C
y A Bx x
=++
(3)
利用Origin 软件对式(3)进行非线性拟合，得到图7所示两个拟合方程，系数A 、B 和C 均已知，
由此建立方程组求解动力学参数v max 、K mA 、K mB 和k iB ，如表1所示。
图7  固定磷脂酰胆碱浓度时乙醇胺浓度对速率的
Lineweaver-Burk 图
表1  动力学模型参数
参数 v max
/μmol·mL·min –1
K mA
/mmol·L –1
K mB
reaction kinetics mechanism期刊/mmol·L –1
k iB
/mmol·L –1
双倒数法
58.52 0.41 0.94 1.52
Matlab 59.35 0.38 1.01 1.50
这种方法成熟、直观，但推导过程繁琐，尤其在体系较为复杂的情况下，运算量大且易出错。因此，本文尝试用Matlab 软件直接求解动力学参数，动力学方程特点为无约束条件、非线性，可选用Fminsearch 函数进行参数求解。对于双底物酶催化反应，方程中有两个自变量C A 和C B ，以C B =50mmol/L 时的动力学数据进行拟合，也可求得一组参数，如表1所示。
由表1对比可见，两种方法所求参数别无二致，使用Matlab 软件求解结果准确、方便快捷，可用来模拟PLD 催化合成PE 底物抑制动力学，也为其他复杂动力学模型求解提供参考。
将所求参数代入式(1)，得酶催化反应的动力学方程，如式(4)。
A B
B
A B B A
59.350.38(1)  1.011.50
C C v C C C C C =
+++
(4)
4  动力学模型验证
改变底物PC 和EA 浓度进行动力学实验，验证上述磷脂酰基转移反应底物抑制动力学模型。结果如图8所示，实线表示模型数据，散点表示实验数据。由图8可见，在较低PC 浓度下，增加EA 浓度反应速率反而降低；而随着PC 浓度增高，EA 的抑制作用减缓。证明了EA 和PC 分别通过增加或减少“死端复合物”浓度而影响反应速率的机制。模型预测与实验数据基本吻合，符合竞争性抑制反应动力学规律。依据所得动力学模型不仅可预测PLD 催化PC 制备PE 反应的进程，而且可指导反应操作方式优选及反应器设计。
5  结论
双相反应体系中，PLD 催化PC 磷脂酰基转移
图8  磷脂酰基转移反应底物抑制动力学模型的验证
[0.2mol/L 乙酸缓冲溶液（pH 5.5），28℃]