山西农业科学2021，49（5）：531-538
陆地棉脂氧合酶家族基因的生物信息学及表达分析
韩立军，刘萌萌，刘宝玲，王志龙，薛金爱，李润植
（山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西太谷030801）
摘要：棉花是我国重要的战略物资，然而在当今全球自然环境恶化的背景下，棉花的生产受到了严重制约。而脂氧合酶（LOX）能够在多种逆境中表现出应激反应，保证植物的正常生长。通过对陆地棉基因组数据的检索比对，鉴定脂氧合酶家族基因，并对其基因结构、蛋白理化性质、进化关系进行生物信息学分析以及对不同组织和冷、热、盐、PEG共4种非生物胁迫下的基因表达模式进行分析后，进一步对陆地棉幼苗4℃冷胁迫处理下的差异基因进行RT-qPCR分析。结果显示，共鉴定出22个GhLOX家族基因，不均匀分布于A和D基因组的15条染体上，编码775～919个氨基酸，多为酸性亲水性蛋白，其中，有6个定位于细胞质中，16个定位于叶绿体中；进化关系显示，GhLOX家族基因分为9-GhLOX、13-GhLOX I、13-GhLOX II共3个亚家族；基因结构显示，保守基序由5个组氨酸残基相连的38个氨基酸组成，13-GhLOX I、13-GhLOX II亚家族相比于9-GhLOX亚家族基因结构相差较大。GhLOX家族基因在11个组织和4种非生物胁迫下存在差异表达，进一步对4℃低温处理下的6个GhLOX 基因表达量分析表明，GhLOX-A5和GhLOX-D5基因可以快速响应低温胁迫。研究结果可为后续GhLOX家族基因在陆地棉冷胁迫中的功能研究
奠定基础，也为棉花高产提供一定的理论依据。
关键词：陆地棉；脂氧合酶（LOX）；生物信息学；基因表达模式；冷胁迫
中图分类号:S562文献标识码:A文章编号:1002-2481（2021）05-0531-08
Bioinformatics and Expression Pattern Analysis of Lipoxygenase
Family Gene in Gossypium hirsutum L.
HAN Lijun，LIU Mengmeng，LIU Baoling，WANG Zhilong，XUE Jin'ai，LI Runzhi
（Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：Cotton in China is a raw material of great strategic importance,but the production of cotton has been seriously restricted with the deterioration of the global natural environment.Lipoxygenases are involved in various environmental stresses response to ensure the normal growth of plants.Lipoxygenase family genes in Gossypium hirsutum L.were identified by blasting based on transcriptome data,the gene structure,protein physicochemical properties,evolutionary relationship were analyzed using the bioinformatics tools.The gene expression patterns in different tissues and cold,heat,salt and PEG abiotic stresses were analyzed,and the differe
ntial expression genes of Gossypium hirsutum seedlings under4℃cold stress were further analyzed by RT-qPCR.The results showed that a total of22 GhLOX family genes,encoding775-919amino acids,were identified,which were unevenly distributed on15chromosomes of A and D genomes,most of which were acidic hydrophilic proteins.6GhLOX genes were located on cytoplasm and other16GhLOX family genes were located on chloroplasts.Evolutionary relationship showed that tthe GhLOX family genes was divided into three subfamilies,9-GhLOX,13-GhLOX I and13-GhLOX II,respectively.The gene structure showed that conserved motif was composed of38amino acids linked by5histidine residues.The gene structure of13-GhLOX I and13-GhLOX II subfamilies was quite different from that of9-GhLOX subfamilies.The gene expression pattern showed that most of13-GhLOX I and13-GhLOX II subfamilies genes had tissue expression specificity,particularly GhLOX-A5and GhLOX-D5had high expression in Torus and under four abiotic stresses.Further RT-qPCR analysis showed that GhLOX-A5and GhLOX-D5genes could rapidly respond to low temperature stress.The research results will lay a foundation for the follow-up study on the function of GhLOX family genes in Gossypium hirsutum L.under cold stress,and also provide a theoretical basis for breeding high-yielding cotton.
Key words：Gossypium hirsutum L.;lipoxygenase;bioinformatics;gene expression pattern;cold stress
脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）广泛存在于动植物及真菌中，属氧化还原酶，是一种含非血红素铁
收稿日期:2021-01-07
基金项目：国家自然科学基金项目（31201266，31401430）；山西省高等学校科学研究优秀成果培育项目
作者简介：韩立军（1995-），男，山西汾阳人，在读硕士，研究方向：分子生物学。薛金爱、李润植为通信作者。
山西农业科学2021年第49卷第5期
的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，专一催化具有顺，顺-1，4戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应[1]。在植物中，LOX的作用底物主要是亚油酸和亚麻酸[2]，其中，9-LOX和13-LOX分别能够催化底物生成9S-氢过氧化十八碳二烯酸（9-HPOD）和13S-氢过氧化十八碳二烯酸（13-HPOD），之后又经过一系列代谢途径和酶促反应，最终生成氧脂素（Oxylip-ins）[3]，氧脂素可增强植物抗逆性[4]。研究发现，LOX 具有促进种子萌发过程中储藏脂质（TAG）的降解、调控植物营养器官的生长发育、增强植物抵抗生物与非生物胁迫以及产生植物特有香气等功能[5]。LOX是茉莉酸（JA）合成途径中的第1个关键酶[6-7]，进而诱导抗逆基因表达以抵御环境胁迫。研究还发现，LOX基因在植物的根、茎、叶、花、果实、种子等组织中均有差异表达[8]；番茄中14个LOX在热、冷、干旱、盐4种非生物胁迫下呈现出不同的表达量[9]，其中，冷胁迫是影响农作物产量和品质的重要因素之一。
棉花是我国重要的纤维作物和油料作物，在我国经济发展中具有不可或缺的作用[10]。研究表明，棉花起源于亚热带，适合生长在温暖的气候环境中，而在我国北方棉区，气候寒凉，在棉花生长早期可能会遇到倒春寒等低温天气，不仅会使植物细胞膜流动性减弱，细胞通透性增大，导致内容物流失，严重影响棉花发育，而且会造成植物死亡[11-13]；同时棉花幼苗易受真菌感染，最终影响棉花产量和棉纤维品质。因此，探究棉花应对冷胁迫的响应机制对我国棉花生产与安全具有重要意义。
陆地棉（Gossypium hirsutum L.）是异源四倍体（4n＝52），由A基因组和D基因组组成[14-15]。本研究基于已经公布的棉花基因组数据，对GhLOX家族基因进行鉴定，对其基因结构、氨基酸理化性质、进化关系进行生物信息学分析，并对GhLOX家族基
因在不同组织和不同非生物胁迫下的差异表达模式进行分析后，进一步对部分GhLOX基因在4℃冷胁迫下的表达模式进行RT-qPCR验证，旨在筛选GhLOX差异基因，为今后GhLOX的功能研究奠定基础，并为我国棉花安全生产提供一定理论依据。
1材料和方法
1.1陆地棉GhLOX基因家族成员的鉴定、染体定位和理化性质分析
在拟南芥数据库TAIR（www.arabidopsis. org/）中获得6个AtLOX蛋白序列，在陆地棉数据库Cott
onFGD（/）和Phytozomez数据库（phytozome.v/pz/）中进行BLASTP 比对，获得陆地棉GhLOX同源蛋白质序列，删除重复序列，用pfam（/）和CDD进一步删除不含有PLAT（PF01477）和Lipoxygenase （PF00305）结构域的序列，最终获得陆地棉GhLOX 家族成员。利用TBtools进行染体定位及命名。
利用在线软件SIB（/）预测氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、不稳定系数和亲水性指数。使用LocTree3（/ser-vices/loctree3/）预测亚细胞定位。利用在线网站NPSA（prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）进行GhLOX蛋白质二级结构预测。
1.2陆地棉GhLOX基因结构及保守基序分析
利用在线网站GSDS（gsds.cbi.pku.edu/）预测陆地棉LOX基因结构；利用在线网站MEME （/）预测陆地棉LOX基因保守基序，参数设定为默认值，保守基序数目为12。1.3陆地棉GhLOX家族基因系统进化分析
在NCBI中获得水稻、萝卜、拟南芥LOX蛋白序列（表1）。
表1萝卜、拟南芥、水稻LOX基因登录号
在MAGE 7.0软件里采用邻接方法
（Neighbor-joining ，NJ ）对拟南芥、水稻、胡萝卜和陆地棉LOX 蛋白构建系统进化树，抽样次数（Bootstrap ）设置为1000次。
1.4陆地棉GhLOX 家族基因的组织特异性及4种非生物胁迫下的表达模式分析
在棉花数据库CottonFGD 中下载陆地棉LOX 基因家族在不同组织及冷、热、盐、PEG 这4种胁迫下的转录组数据，
利用软件TBtools 绘制GhLOX 家族基因差异表达热图。1.5
陆地棉部分基因在4℃冷胁迫下的表达分析
根据陆地棉GhLOX 冷胁迫的热图结果，每个
亚家族各选取2个基因，分别为9-LOX 亚家族的GhLOX -D9.2、GhLOX -D13；13-LOX Ⅰ亚家族的GhLOX -A8.1、GhLOX -D8.1；13-LOX Ⅱ亚家族的
GhLOX-D5、GhLOX-D10，用Primer 6.0设计特异性
引物（上海生工公司合成引物，表2）。表2GhLOX 实时荧光定量PCR 分析所用引物
下游引物序列（5′—3′）ACGGCGGTGAAGTCCAAA ATAACAACACTGCCTGTGATTG CCAATGAAGAACAGGCGTTGA TCATCGTCGGTGGTCCATTC CCCAGACAGGTTTAACAAAGAGG TGGCTCAGCATCTCCGAAT GGCTCTGGAAACGCAAATCA
基因名称
GhLOX-A8.1GhLOX-D8.1GhLOX-D5GhLOX-D9.2GhLOX-D10GhLOX-D13histion
上游引物序列（5′—3′）AACAAGACCAGCAAGAGAATGA AGCTAACAAGACCAGCAAGAA CTCCCACTACCACAACCTCAA TACCCATACGCCGGATACCT AAAGCCCATCATCTCCATTTCAC GCTTCCCAATAACCTCTTCTTC AAGCCTCATCGATACCGTCC
取长势良好且大小一致的陆地棉冀丰1271的幼苗于4℃低温培养0、1、3、6、12、24、48h ，提取叶片
RNA ，反转录为cDNA 。以hisone 为内参基因，利用RT-qPCR 进行差异表达分析。总反应体系为10μL ，其中，TB Green 5μL ，上下游引物各0.4μL ，cDNA 0.8μL ，ddH 2O 3.4μL 。反应条件为：95℃5min ；95℃5s 、58℃30s 、72℃30s ，40个循环。每个样品设置
3次重复，
用2-ΔΔCT 法计算基因相对表达量。2
结果与分析
bootstrap 软件2.1
陆地棉GhLOX 家族基因成员的鉴定、染体
定位和蛋白理化性质分析
通过检索比对，最终鉴定出22个GhLOX ，根据染体位置和顺序进行命名，
结果如图1所示
。韩立军等：陆地棉脂氧合酶家族基因的生物信息学及表达分析
山西农业科学2021年第49卷第5期
表3GhLOX 蛋白理化性质分析
不稳定系数38.8938.2748.1639.1145.6345.8536.8732.8039.0842.1544.1238.8147.5439.4645.5447.1736.5930.7852.6237.8942.8942.72
亲水指数-0.385-0.361-0.429-0.388-0.418-0.405-0.302-0.305-0.374-0.422-0.445-0.391-0.43-0.389-0.428-0.399-0.318-0.256-0.295-0.374-0.416-0.430
亚细胞定位叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体细胞质细胞质叶绿体叶绿体细胞质叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体叶绿体细胞质细胞质叶绿体叶绿体叶绿体细胞质
理论等电点
6.606.39
7.175.846.216.265.685.236.05
8.375.866.507.415.786.136.145.635.316.136.088.075.77
分子质量/ku
99.6992.23103.46103.33101.1197.3698.9798.5299.68104.1198.8999.56103.66103.1399.05100.5399.09100.9987.6099.81104.1598.66
基因名称
GhLOX-A2.1GhLOX-A2.2GhLOX-A3GhLOX-A5GhLOX-A6.1GhLOX-A6.2GhLOX-A8.1GhLOX-A8.2GhLOX-A9GhLOX-A10GhLOX-A13GhLOX-D2.1GhLOX-D2.2GhLOX-D5GhLOX-D6.1GhLOX-D6.2GhLOX-D8.1GhLOX-D8.2GhLOX-D9.1GhLOX-D9.2GhLOX-D10GhLOX-D13
基因ID
Gohir.A02G031100.1Gohir.A02G031300.1Gohir.A03G128200.1Gohir.A05G067300.1Gohir.A06G210300.1Gohir.A06G210400.1Gohir.A08G210200.1Gohir.A08G210400.1Gohir.A09G215000.1Gohir.A10G054600.1Gohir.A13G108000.1Gohir.D02G038000.1Gohir.D02G151700.1Gohir.D05G070100.1Gohir.D06G210600.1Gohir.D06G210700.1Gohir.D08G227100.1Gohir.D08G227200.1Gohir.D09G072200.1Gohir.D09G217500.1Gohir.D10G056600.1Gohir.D13G111000.1
氨基酸数目
877814912905886856872871873919865877912904868886872894775873919865
由图1可知，22个GhLOX 不均匀地分布在
15条染上，
其中，在A 亚组的8条染体上（A2、A3、A5、A6、A8、A9、A10、A13）分布着11个GhLOX
基因，在D 亚组的7条染体上（D2、D5、D6、D8、D9、D10、D13）分布着11个GhLOX 基因；在A
2、A6、A8、D2、D6、D8、D9这7条染体上各有2个GhLOX
基因，
其余8条染体上均只有1个GhLOX 基因。对22个GhLOX 家族基因蛋白的理化性质分析表明，编码氨基酸数目为775～919个；分子质量
范围为87.6～104.15ku ；除GhLOX-A3、GhLOX-D2.2、
GhLOX-A10、GhLOX-D10呈碱性外，其余18个GhLOX 均呈酸性；11个GhLOX 的不稳定系数小于
40，结构稳定性，其余11个LOX 蛋白不稳定系数大于40，表现出不稳定性；亲水指数均为负值，即均为亲水性蛋白；GhLOX-A8.1、GhLOX-A8.2、GhLOX-A13、GhLOX-D8.1、GhLOX-D8.2、GhLOX-D13这6个
LOX 蛋白定位在细胞质中，其余16个均定位在叶绿体中（表3）。
2.2陆地棉GhLOX 家族基因系统进化分析利用拟南芥、水稻、萝卜、陆地棉LOX 蛋白构建
进化树如图2所示，根据催化底物时的不同反应位置，将GhLOX 蛋白分为9-GhLOX 和13-GhLOX 共2类，
13-GhLOX 亚家族又分为Type Ⅰ和Type Ⅱ共2类，其中，Type Ⅰ类LOX 蛋白序列相似性高达75%，缺乏叶绿体转运肽，Type Ⅱ类LOX 蛋白间序列相似性为35%左右，含有叶绿体转运肽[8]。在GhLOX 基因家族中，13-GhLOX Ⅰ亚家族最大，有9个基因；13-GhLOX Ⅱ亚家族最小，有6个基因；9-GhLOX
家族有7个基因。从进化树中可以看出，陆地棉与萝卜亲缘关系更近。2.3
陆地棉GhLOX 基因结构及保守基序的分析通过对GhLOX 编码的氨基酸序列进行比对发
现，大部分氨基酸位点是保守的；由38个氨基酸残基组成的结构域中包含5个组氨酸（His ，H ）残基，
其通过形成片段“H-X 4-H-X5-H-X 17-H-X 8-H ”来结合铁原子（图3），在LOX 酶发挥功能时具有重要作用[16-17]。
GhLOX 基因家族外显子数目为7～10个，其中，9-GhLOX 的基因结构相似，外显子数目为8～10个；13-GhLOX 亚家族的基因结构相差较大，且13-GhLOX Ⅱ相比于13-GhLOX Ⅰ基因结构相差较大。其中，13个GhLOX 基因同时拥有5′-UTR 和3′-UTR ，4个GhLOX 基因只有3′-UTR ，1个GhLOX 基因只有5′-UTR ，4个GhLOX 基因没有非翻译区。此外，13-LOX 中有3个基因都含有最长内含
子，3个LOX 亚家族表现出了相似的基序排序，除GhLOX -A2.2、GhLOX -A 3、GhLOX -A5、GhLOX -
D2.2、GhLOX-D5不含有Motif11外，其余基因均含有Motif1～Motif12，值得注意的是，GhLOX-D5基
因含有2个Motif10（图4）。
韩立军等：陆地棉脂氧合酶家族基因的生物信息学及表达分析