(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(10)申请公布号 CN 103074431 A
(43)申请公布日 2013.05.01
(21)申请号 CN201310012196.1
(22)申请日 2013.01.14
(71)申请人 山东大学齐鲁医院
    地址 250014 山东省济南市历下区文化西路107号
(72)发明人 王传新 张欣 王海燕
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限公司
    代理人 彭成
(51)Int.CI
      C12Q1/68
      C12N15/11
                                                                  权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
      检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒及方法
(57)摘要
      本发明公开了一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，包括miR-128的逆转录引物和检测引物、U6的逆转录引物和检测引物、miRNA-16的逆转录引物和检测引物，如SEQ IDNO：1～9所示。一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液。一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，步骤如下：（1）将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清液；（2）RT-PCR扩增；（3）制作标准曲线（4）计算：得出基因的校正起始拷贝数Q；将miR-128的Q值与内参基因U6、miR-16的Q值的几何平均数相比，得到miR-128的相对表达量。本发明的检测方法，为结直肠癌的早期发现、早期提供了重要的参考依据。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，其特征在于：包括：           
（1）miR-128的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，检            测引物的序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示：           
miR-128-RT：           
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’；           
miR-128-F：5’-GGCTCACAGTGAACCGGT-3’；           
miR-128-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；           
（2）U6的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示，检测引物            的序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示：           
U6-RT：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC；           
U6-F：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC；           
U6-R：AAATATGGAACGCTTCACGAATT；           
（3）miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，检            测引物的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示：           
miRNA-16-RT：           
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’；           
生活中常见的数据库应用miRNA-16-F：5’-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’；           
miRNA-16-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。           
2.一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的            检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三            羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下：吐温20：2.5%；            三羟甲基氨基甲烷：50mmol/L；乙二胺四乙酸：1mmol/L；牛血清白蛋白：1%。           
3.根据权利要求2所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于：所述            检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由Syber Green Ⅰ            荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。           
4.根据权利要求3所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于：所述            反应液中各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/ml，dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三            羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM。           
5.权利要求1所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用引物在定性检测血清miR-128或            定量检测血清miR-128表达量中的应用。           
6.权利要求2或3或4所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒在定性检测血清            miR-128或定量检测血清miR-128表达量中的应用。           
7.一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，其特征在于：步骤如下：           
（1）将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，离心，分离上清液；           
（2）RT-PCR扩增：向上述分离的上清液中加入SEQ ID NO：1所示的miR-128的逆转录            引物，进行反转录得cDNA，取cDNA为模板，加入SEQ ID NO：2、3所示的引物以及PCR            反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq；同时，从人结直肠癌细胞株HT29细胞中提取            miRNAs，逆转录成cDNA，10倍梯度稀释，作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，            记录Cq值；内参基因U6、miR-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测            引物外，方法相同；           
（3）制作标准曲线：上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵       
    坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=10<sup>（-1/S）</sup>-1，计算扩增效率E；           
（4）计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样            本阈值Cq（T）和校对样本阈值Cq（C），根据公式Q=（E+1）<sup>-△Cq</sup>，△Cq=[Cq（T）-Cq（C）]，            得出基因的校正起始拷贝数Q；将miR-128的Q值与内参基因U6、miR-16的Q值的几何平            均数相比，得到miR-128的相对表达量。