南极黄丝瓜藓（Pohlia nutans）2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因PnODD1在植物抗逆中的作用
南极洲位于地球南端,四周被三大洋包围,与其他大陆隔离,独特的地理位置造就了其独特的气候。酷寒、干燥、烈风和强紫外辐射等制约了陆生植物的生长发育。
苔藓植物(Bryophyte)是南极大陆主要植被类。黄酮类化合物是植物体内最大的一类次生代谢物,参与植物生长发育以及响应非生物胁迫。
尽管类黄酮代谢途径在很多植物中得到了很好的研究,但在高等植物的低等类中的研究却很少。目前,地钱查尔酮异构酶、小立碗藓查尔酮合酶和钝磷紫背苔黄酮合酶等少数基因被报道。
2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase,2-ODD)是植物基因组中第二大酶家族,参与各种氧合/羟化反应,在植物和动物发育、转录调节、核酸修饰/修复和次级代谢合成途径中发挥重要作用。类黄酮代谢途径中的2-ODD家族基因也为丰富的黄酮类化合物形成提供保障。
本文从南极黄丝瓜藓(Pohlia nutans)转录组中选取了一个高度响应UV-B的基因。生物信息学分析为类黄酮代谢途径关键2-ODD家族基因,命名为PnODDl(Pohlia nutan2 2-ODD1),并对其进行了克隆分析和功能研究。
具体结果如下:1.强紫外辐射(UV-B)对南极黄丝瓜藓与新疆地区泛生丝瓜藓的影响本课题组研究发现,与山东地区的卵蒴丝瓜藓(Pohlia proligera)相比,南极黄丝瓜藓对紫外辐射的耐受性高,且这种抗性与黄酮类化合物相关。本文进一步研究了南极黄丝瓜藓与新疆泛生丝瓜藓(Pohlia cruda)对紫外辐射响应的差异。
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UV-B(70μW/cm2)辐射处理12h后,新疆泛生丝瓜藓植株出现弯曲和蓬乱、叶片皱缩、颜变暗,部分植株顶端枯死,受损伤严重;而南极黄丝瓜藓仅有颜变化,生长状态较好。与新疆泛生丝瓜藓相比,UV-B处理后南极黄丝瓜藓的活性氧自由基和丙二醛含量水平增幅较小,但却积累了更多的黄酮类化合物。
同时,UV-B处理后,两种抗氧化酶在两种苔藓体内活性均显著提高,但是南极黄丝瓜藓抗氧化酶的提升幅度小于新疆泛生丝瓜藓。以上结果表明,南极黄丝瓜藓对紫外辐射的抗性较新疆泛生丝瓜藓强,这种抗性主要依赖于体内合成的大量黄酮类物质。
2.南极黄丝瓜藓PnODD1的克隆、表达分析和功能研究从南极黄丝瓜藓转录组中选取了一个高度响应UV-B的基因,对其进行了克隆、表达分析和功能研究。生物信息学分析发现,该基因属于类黄酮代谢途径的2-ODD家族成员(PnODD1)。
同时,疑是类无花青素双加氧酶(LDOX/ANS-like)基因。PnODD1大小为1510 bp,含有一个1050 bp的ORF,编码346个氨基酸,蛋白分子量为38.4 kDa。
多序列比对发现,PnODDl与其它2-ODD超家族基因的序列相似性为39.5-48.9%,具有典型N端保守的DIOX_N结构域和2-OD-FeⅡ_Oxy结构域;另外,与其它2-ODD一样,存在Fe2+结合位点残基(His219、Asp221 and His275)和AKG(2-酮戊二酸)结合位点残基(Tyr204、His219、Asp221、His275、Arg285和Ser287)。通过SWISS-MODEL进行了同源建模,空间结构显示,PnODD1蛋白由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲三者在中央部位构成一个空腔,即为铁离子(Fe2+)结合位点。
系统进化树分析发现,PnODD1与其他物种2-ODDs基于保守的结构和序列特征(如氨基酸同源性和保守基序)而共享一个共同的进化祖先;与钝磷紫背苔FNSI类聚同一分支,表明了二者具有很近的亲缘关系。通过生信在线预测以及PEG-CaCl2法介导的瞬时表达载体转入拟南芥原生
质体的实验,研究了蛋白的亚细胞定位,结果显示PnODD1主要分布于细胞质膜和细胞质基质。
利用RT-qPCR技术分析了PnDD1基因对非生物胁迫的响应。结果表明,PnODD1基因在D-Mannitol、UV-B、盐胁迫下均显著上调表达,说明其参与南极黄丝瓜藓适应环境胁迫。
将PnODD1基因在拟南芥中组成型表达,研究了其生物学功能。正常生长状态下,过表达PnODD1对拟南芥的生长发育没有影响。
过表达PnODD1增强了拟南芥对盐胁迫的抗性。在125mMNaCl胁迫下,Col-0、AtOE1和AtOE2种子萌发率分别是46.7%、91.7%和 86.7%;150 mM NaCl 胁迫下 Col-O、AtOE1 和AtOE2种子萌发率分别是35.0%、71.6%和75.3%;根长研究发现,在125mM或150mMNaCl处理下,过表达PnODD1拟南芥主根均显著长于野生型拟南芥。
同时,过表达PnODD1增强了拟南芥对渗透胁迫的抗性。在0.1 M或0.3 M D-甘露醇处理后,过表达PnODD1拟南芥的种子萌发率、主根长度、植株鲜重以及侧根数目均显著高于野生型拟南芥。
UV-B处理12h后,野生型拟南芥生长受到了明显的抑制,茎秆细小、叶片蜷皱和叶片表面积变小;过表达PnODD1缓解了UV-B对拟南芥生长的抑制效应。逆境条件会导致植物体内脱落酸(Abscisic acid,ABA)水平急剧升高,其抑制种子萌发,影响植物生长。
过表达PnODD1降低了拟南芥对ABA的敏感性。1.0μMABA处理下,AtOE1和AtOE2种子萌发数分别是93.3%和91.7%,显著高于野生型的85.3%,过表达系的主根长度约为野生型的1.30倍。
拟南芥总黄酮代谢谱分析发现,PnODD1影响了非生物胁迫下拟南芥体内黄酮类化合物的种类和含量。另外,渗透胁迫下,PnODD1通过影响干旱响应基因(P5CS1和AtKIN1)及ABA信号途径相关基因(AtABF3、AtMYB2、AtRD22和AtDDEB2A)的表达,增强了过表达拟南芥的抗旱性。
通过构建原核表达载体,对PnODD1基因进行异源表达并优化了表达条件,确定了在诱导温度16℃、IPTG浓度0.11mM和诱导时间24h条件下重组蛋白表达量最高;利用HLPC进行了重组蛋白与多种底物的产物分析,发现PnODD1蛋白可以催化柚皮素(Naringenin,NAR)生成新化合物。体外NAR给养实验发现,过表达PnODD1缓解了NAR对植物生长的抑制作用。
综上所述,PnODD1通过影响拟南芥体内黄酮类化合物含量和胁迫响应相关基因的表达,增强了植株对非生物胁迫的抗性,为揭示苔藓适应极地环境的特殊机制提供了重要参考,丰富了南极植物基因资源。