遗传多样性分析的方法与步骤
摘要：本文对生物的遗传多样性进行阐述，并综述了检测遗传多样性的形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和分子标记4种遗传标记的发生与发展过程,并比较了各自的优缺点及其应用。
关键词：遗传多样性；形态学标记；细胞学标记；生物化学标记；DNA分子标记
        Genetic Diversity Analysis Method and Steps
                       
Abstract: In this paper, the biological genetic diversity were summarized, and elaborates the detection of genetic diversity morphology mark, cytology mark, biochemical markers and molecular marker and genetic markers of the occurrence and development of the process, and compare their advantages and disadvantages and application.
Keywords: genetic diversity; Morphological markers; Cytology mark; Biochemical markers;
DNA molecular markers
前言 遗传多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础,任何物种都有其独特的基因库或遗传组织形式[1]。广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和,但通常所说的遗传多样性是指种内的遗传多样性,即种内不同种之间或一个种内不同个体的遗传变异[2]。遗传多样性的表现形式是多层次的,可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及DNA序列等不同方面来体现,其中DNA多样性是遗传多样性的本质[3]。通常,遗传多样性最直接的表现形式就是遗传变异水平的高低。然而,对任何一个物种来说,个体的生命是短暂的、有限的,而由个体构成的种或种系统(宗、亚种、种)在自然界中具有其特定的分布格局,在时间上连续不断,是进化的基本单位。因此,遗传多样性不仅包括变异水平的高低,而且包括变异的分布格局,即种的遗传结构。种遗传结构上的差异是遗传多样性的重要体现,一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于种内遗传变异的大小,也有赖于种的遗传结构[4]。
1 遗传多样性的意义
    根据联合国5生物多样性公约，生物多样性是指所有来源的活的生物体中的变异性, 包括陆地、海洋和其它水生生态系统及其所构成的生态综合体[ 1-7] 。遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分, 是生态系统多样性和物种多样性的基础方面, 任何物种都有其独特的基因库和遗传组织形式, 物种的多样性也就显示了基因的多样性。因此, 广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。遗传多样性是重要的生物资源。遗传多样性的丧失是人类赖以生存资源的永久性丧失, 随着现代工业和科技的不断发展, 生态环境明显恶化,遗传多样性的研究、保护及可持续利用已成为全球瞩目的问题。所以广义上讲, 保护遗传多样性就是保持生物多样性和人类赖以生存的生态环境。
2、遗传多样性研究的方法及其步骤
对遗传多样性的系统研究始于十九世纪,达尔文在《物种起源》中用大量资料和证据揭示出生物中普遍存在变异现象,并发现了大部分变异有遗传现象,他把这种可遗传的变异称为多样性。随着孟德尔遗传定律的重新发现,摩尔根染体遗传学及后来发展的细胞遗传学的诞生为体遗传理论的发现奠定了基础并提供了科学的实验证据,充分证实了在自然界中确实存在大量的遗传变异。随着生物学理论和技术的不断进步,以及实验条件和方法的不断改进,检测遗
传多样性的方法日益成熟和多样化,可从不同的角度和层次来揭示物种的变异。遗传标记(genetic markers)的发展经历了形态学标记(morphological markers)、细胞学标记(cytological markers)、生物化学标记(biochemical markers)和分子标记(molecular markers)4个主要阶段。
2.1　形态学标记
染体多态性
形态学标记是与目标性状紧密连锁、表型上可识别的等位基因突变体,即植物的外部特征特性。典型的形态学标记用肉眼即可识别和观察;广义的形态学标记还包括借助简单测试即可识别的性状,如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法。通常所利用的表型性状有2类,一类是符合孟德尔遗传规律的单基因性状,如质量性状、稀有突变等,另一类是由多基因决定的数量性状。由于自然界中单基因性状较少,作为遗传标记,主要是用于一些农作物、林木、园艺作物及其野生近缘种的遗传多样性研究,而且多用于研究交配系统、基因流和选择等进化因素。而数量性状的变异则大量存在,对其进行研究同样能分析居或个体的遗传变异,并且结合数量遗传学的方法来研究数量性状的遗传变异,通过特定的杂交试验和后代测定能分析性状在亲本与子代间的传递规律,
并将影响变异的遗传因素同环境因素区分开,从而确定遗传因素在性状变异中的相对重要性;同时能分析遗传和环境的交互作用,甚至可以估算控制数量性状的多基因的位点数目。形态学标记已被广泛应用于遗传图谱的构建、品种演化与分布历史推测[8]、种质资源遗传多样性的分析[9,10]、种质资源的分类与鉴定[11,12]、杂交亲本的选配和核心种质的构建[13]等研究中。虽然用形态学标记研究遗传多样性具有简便、易行、快速等特点,但是,由于表型性状是基因型与环境共同作用的结果,往往因环境因素的影响而发生变化,有时表型性状的变异并不能真实反映遗传变异;同时,形态标记数量有限,观测标准容易受到观测者的主观判断影响。因此,要更加准确、全面地了解物种的遗传多样性,仅仅依赖形态标记是远远不够的,还必须结合其他的标记技术,进行更深层次的研究[14]。
2.2　细胞学标记
细胞学标记主要是染体的核型和带型分析。染体是遗传物质的载体,是基因的携带者。与形态学变异不同,染体的变异必然会导致遗传变异的发生,是生物遗传变异的重要来源。研究表明,在任何生物的天然居中,都存在或大或小的染体变异。染体的变异主要表现为染体组型特征的变异,包括染体数目的变异(整倍性或非整倍性)和染体结构的变异(缺失
、易位、倒位、重复等),染体的形态(着丝点位置)、缢痕和随体等核型特征也是多样性的来源。染体分带(chromosome banding)指借助于一套特殊的处理程序,使染体显现出深浅不同的带纹,常见染体带型有C带、G带、R带、Q带等[15]。在植物中,染体的多倍性现象广泛存在,Lewin研究发现约7%的双子叶植物有多倍现象,共涉及114科660属2 800种[16]。植物染体的数目、形态等是最稳定的细胞学特征之一,染体的核型、带型等是表明该种系统演化位置以及和近缘种亲缘关系的重要依据,是探讨植物亲缘关系和进化趋势的一个重要途径[17]。Tuna等[18]研究了无芒雀草(Bromusinermis)染体的核型和带型,推测四倍体无芒雀草可能是异源四倍体,八倍体无芒雀草不是由四倍体的染体直接加倍形成的。Liu等[19]对山龙眼科Leucadendron属27个物种的核型进行研究,发现它们的染体都具有对称性,从细胞学的角度证明了该属的原始性。
2.3 生化标记生化标记( biochemical markers)
生化标记生化标记，主要包括同工酶, 是鉴定外源DNA 和研究物种起源进化的有效工具, 它们比形态标记更能提供较大的差异信息,1966 年, Hubby、Lewontin、Johnson 和Harris 分别报道了利用凝胶电泳技术结合酶的特异性染对果蝇和人类体遗传变异的定量研究, 打开
了用一种全新方法研究天然体变异的大门。这种方法就是后来在系统学和进化研究领域广泛应用的同工酶电泳技术( Isozyme electrophosis) 。其基本原理是根据不同蛋白质所带电荷性质不同, 通过蛋白质电泳或谱技术以及专门的染反应显示出不同形式的同工酶, 从而鉴别不同的基因型。生化标记具有实验程序简单, 易操作, 成本较低, 比较稳定, 比形态学标记更能提供较大的差异信息等优点, 但是生化标记数目在一定程度上仍然有限,且不具有共显性, 因而限制了它的应用。
2.3.1 分子标记
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA 序列或蛋白质。狭义的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。本文指的分子标记即为后者。由于DNA 分子标记克服了同工酶遗传标记数量有限的不足。自1980 年以来, 分子标记技术发展很快。
2.3.2限制性片段长度多态性( RFLP)
RFLP 是最早发展的分子标记, 其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA 后,与同位素或非同位素标记的探针杂交, 从而显示与探针同源顺序的酶切片段在长度上的差异。
RFLP 标记具有以下特点: 呈孟德尔遗传, 不受环境影响; RFLPB 标记等为基因之间呈共显性; 非等位的RFLP 标记之间不存在上位效应及其它形式的基因互作; 结果稳定可靠, 重复性好。但是分析程序复杂, 技术难度大, 费时, 成本高, 需要适合的探针和放射性同位素, 而且每次反应需要DNA 量较大, 多态位点数目有限, 所以应用受一定的限制。
2.3.3随机扩增多态性DNA(RAPD)
RAPD 技术是由Williams 和Welsh 领导的两个研究小组同时提出的, Williams 称之为RAPD,Welsh 称之为AP- PCR[ 6, 17, 18] 。它是利用一个随机序列的寡核苷酸作引物, 通常为10 个核苷酸,以基因组DNA 作为模板进行PCR 扩增反应, 经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 序列的多态性。RAPD标记检测灵敏方便, 多态性强, 可检测出RFLP 标记不能检测的重复顺序区, 因此可填补RFLP 图谱的空缺。但是RAPD 是显性标记, 容易受反应条件影响, 稳定性较差。
2.3.4扩增片段长度多态性(  AFLP)
AFLP 是Zabeau 和Vos 等发明的一项技术。AFLP 主要包括模板DNA 的制备, 引物的组装,
酶切片段被选择性扩增。其实质是利用两种或两种以上的酶切割DNA, 形成不同酶切位点的限制性酶切片段, 在所得的酶切片段上加上双链人工接头, 作为PCR 扩增的模板。显然, AFLP 兼具备了RFLP 和RAPD 两种标记方法的优点。而且AFLP 能提供比RFLP 和RAPD 更多的多态性信息, 但是AFLP 在技术上复杂, 较难操作。
2.3.5微卫星标记微卫星DNA
微卫星标记微卫星DNA ，又称简单重复序列( Simple SequenceRepeats, SSR),是由重复数目可变的串联重复核心序列组成,如( GA) n,( GATA) n 等, 长度一般小于100bp, 在染体上随机分布,由于重复次数不同及重复程度的不完全而形成多态性。微卫星标记集中了其他分子标记的优点:典型的共显性和多等位基因, 多态性较高, DNA 的用量少,扩增结果的重现性高。建议检测遗传多样性的方法是随着生物学,尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善的, 本文主要从形态学水平,细胞学水平, 生化水平和分子水平对遗传多样性的检测方法作了扼要介绍,可以看出,不同的检测方法在理论上或在实际研究中都有各自的优点和局限,目前还不到一种完全取代其它方法的技术。因此, 在研究生物的遗传多样性时,可将几种检测方法综合使用,扬长避短, 建立快速有效的综合方法。同时在分子标记中,除RFLP 外,其它分子标记都
是建立在PCR 反应基础上的,又各有所长,所以我们可以借助于PCR, 结合各种分析方法, 更快速、更简单、更可靠地获得分子标记,从而加快遗传多样性的研究进程。
2.4　DNA分子标记
形态学标记、细胞学标记和同工酶标记都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目有限、多态性较差。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列差异为基础的遗传标记,是DNA水平上遗传变异的直接反映,能更准确地揭示种、变种、品种、品系乃至无性系间的差异。与前3种标记相比,DNA标记具有以下优越性:(1)较高的可靠性,直接以DNA的形式表现,不受环境因素、取样部位和发育阶段的影响,不存在基因表达与否的问题;(2)数量多,遍及整个基因组;(3)多态性高,自然存在着许多变异;(4)表现为“中性”,不影响目的基因的表达,与不良性状无必然的连锁;(5)有许多分子标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型与杂合基因型[20-21]。自20世纪90年代以来,DNA分子标记一直是生命科学领域活跃发展的一种生物技术,不仅应用广泛,而且新的分子标记种类不断涌现。各种类型的标记层次特点不同,都有各自的优势和局限性。理想的DNA分子标记应具备以下特点:(1)遗传多样性高;(2)共显性遗传;(3)在基因组中大量存在且分布均匀;(4)表现为“中性”,对目标性状表达无不良影响,与不良性状无必然连锁;(5)稳定性、重
现性高;(6)信息量大,分析效率高;(7)检测手段简单快捷,易于实现自动化;(8)开发成本和使用成本低。但是迄今为止,没有一种标记能完全满足上述特性。因此,在具体的研究中,应该根据所分析材料的遗传背景、研究状况、实验目的以及实验条件来选用最合适的标记技术,或同时采用几种方法进行,以便多层次、多角度、更全面、更准确地揭示物种或种的遗传多样性水平。