蜜蜂性等位基因csd多态性研究
蜜蜂为单双倍数性别决定类型,在蜂中,蜂王和工蜂是雌性,为二倍体,雄蜂是雄性蜂,为单倍体。csd基因为蜜蜂性别决定关键基因,当个体具有两个不同的csd等位基因时发育成雌性,只有一个csd等位基因时发育成雄性,具有两个相同的csd等位基因时发育成二倍体雄蜂。
本研究对csd在中华蜜蜂不同地理体、西方蜜蜂不同亚种、大蜜蜂、小蜜蜂及人工选育的浆蜂中的多态性进行了分析,获得了如下结果：1.不同地理体中华蜜蜂csd基因的多态性分析选取吉林长白山、海南海口、广西南宁、湖北神农架和江西靖安5个区域的中蜂体,用每个个体的头部和胸部提取DNA,用csd基因3区特异引物进行PCR扩增,对目的片段进行克隆,对每个个体挑取1-3个克隆进行测序,总共获得131条csd基因高变区的序列,归属于69个单倍型,其中有9个单倍型为两个以上体共有。系统树表明所有的单倍型在分子系统树上很明显的形成两支(TypeⅠ和TypeⅡ),而来自不同地理体的单倍型则混杂在一起,在系统树上并没有按照地理来源形成五支。
多态性分析表明TypeⅠ的多态性(π=0.06724)显著高于TypeⅡ(π=0.01477).进一步分析五个体TypeⅠ单倍型的多态性,吉林长白山、江西靖安、广西南宁、海南海口和湖北神农架体的
多态性依次为0.09425,0.09987,0.05096,0.04612,0.03588。吉林长白山和江西体的多态性显著高于其它体。
而吉林长白山体和江西靖安体之间,广西南宁体、海南海口体和湖北神农架体之间的的多态性没有显著差异。采用核苷酸分歧度(Dxy)来表示体间csd基因核苷酸多态性。
各体核苷酸分歧度在0.03977-0.09208之间。其中湖北神农架中蜂与广西南宁中蜂之间分歧度最小,为0.03977。
江西靖安中蜂与吉林长白山中蜂分歧度最大,为0.09208,江西靖安中蜂与湖北神农架中蜂、海南海口中蜂的分歧度也很大。利用csd基因3区单倍型序列计算5个中蜂地理体间kimura’s双参数遗传距离,看出各种间遗传距离在0.02367-0.05728之间。
江西靖安中蜂与吉林长白山中蜂的遗传距离最大,湖北神农架中蜂与广西南宁中蜂之间的遗传距离最小根据遗传距离进行UPGMA聚类分析,结果显示先是湖北神农架中蜂与广西南宁中蜂聚在一起,再与海南海口中蜂聚成一支,然后与吉林长白山中蜂聚在一起,最后才与江西靖安中蜂聚在一起。2.不同西方蜜蜂亚种间csd基因的多态性分析我们分析了csd基因在西方蜜蜂不同亚种之间的多态性。
选取高加索蜂、安纳托利亚蜂、卡尼鄂拉蜂、喀尔巴阡蜂、东北黑蜂、法国意蜂这6个亚种,取每只蜜蜂的胸部和头部提取基因组DNA,在csd基因3区设计特异引物进行PCR扩增,对目的片段进行克隆和测序。从高加索蜂,安纳托利亚蜂,卡尼鄂拉蜂,喀尔巴阡蜂,东北黑蜂和意大利蜜蜂中分别获得了6,10,19,14,28和7个单倍型。
我们确定了各个单倍型的外显子,内含子以及编码序列。氨基酸序列分析表明这些西方蜜蜂csd基因编码序列均含有N末端RS结构域,C末端P富含区,以及位于这两个结构域之间的一个富含天冬氨酸和酪氨酸的高变区,高变区主要由天冬氨酸和酪氨酸形成得(N)1-4Y重复序列组成。
我们比较了6个西方蜜蜂亚种间核苷酸变异度,csd基因在所有的6个西方蜜蜂亚种间表现出高的多态性,其中安纳托利亚蜂的π值最高,其π值显著高于东北黑蜂,但是与其他四个亚种的π值比较则没有显著差异。除去安纳托利亚蜂以外,其他5个亚种之间的π值均没有显著差异。
体分析表明6个不同亚种间的成对Fst值在0.01825到0.23848之间,其中安纳托利亚蜂和卡尼鄂拉蜂之间的Fst值最高,而喀尔巴阡蜂和高加索蜂之间的Fst值最低。从这些西方蜜蜂不同亚种间的Fst值来看,高加索蜂与其它五个西方蜜蜂亚种之间的遗传分化水平都非常低,安纳托
利亚蜂,卡尼鄂拉蜂,喀尔巴阡蜂和东北黑蜂间的遗传分化也未见显著差异,除了这几对亚种之外剩余的亚种间均存在极显著的遗传分化。
6个不同西方蜜蜂亚种间的Kimura’s双参数遗传距离在0.04178到0.06341之间,其中安纳托利亚蜂和卡尼鄂拉蜂之间的遗传距离最大,而东北黑蜂和高加索蜂之间的遗传距离最小。根据Kimura’s双参数遗传距离构建UPGMA树,结果表明高加索蜂和东北黑蜂先聚在一起,然后卡尼鄂拉蜂,喀尔巴阡蜂,意大利蜜蜂和安纳托利亚蜂依次和它们聚在一起。
3.小蜜蜂csd基因的多态性分析以广西武鸣小蜜蜂工蜂为实验材料,提取每个工蜂样品的基因组DNA,对csd基因3区进行PCR扩增、克隆和测序,然后分析csd基因的多态性。我们从60只小蜜蜂工蜂个体获得了54条序列,归属于37个单倍型。
以这些单倍型为基础构建系统树,所有单倍型在进化树上形成typeⅠ,Ⅱ和Ⅲ3个进化支。其中typeⅡ和typeⅢ的多态性(π值)非常低,而typeⅠ的多态性比typeⅡ和typeⅢ要高10倍左右。
推测typeⅡ和typeⅢ等位基因可能来自其他基因。因此,我们只对typeⅠ等位基因进行了进一步的分析。
将小蜜蜂的csd基因与蜜蜂属的大蜜蜂、中蜂、意蜂进行比较,结果表明小蜜蜂csd基因多态性显著高于其他3个蜂种。我们确定了typeⅠ等位基因的外显子,内含子以及编码序列。
与西方蜜蜂,中华蜜蜂和大蜜蜂相似,小蜜蜂csd基因编码序列的N末端含有RS结构域,C末端含有P富含区,在这两个结构域之间存在一个富含天冬氨酸和酪氨酸的高变区。在每个等位基因中天冬氨酸和酪氨酸形成(N)1-4Y重复序列,其中大约有一半的等位基因在(N)1-4Y重复后还有另一个重复序列(KHYN)1-4。
基因多态性
我们分析了每个同义位点非同义突变(dN)的数目和同义位点同义突变(dS)之间的关系。结果表明对于所有的等位基因对,dN大于dS,所有等位基因对的dN/dS平均值为1.28。
而且对于新形成的基因,dN-dS回归直线高于dN/dS=1,然而对于早已分化形成的的等位基因,dN-dS回归直线低于dN/dS=1。这些结果表明非同义突变选择性地有利于年轻的等位基因。
4.大蜜蜂csd基因的多态性分析以广西崇左大蜜蜂和海南岛大蜜蜂工蜂为实验材料,提取每个工蜂样品的基因组DNA,对csd基因3区进行PCR扩增、克隆和测序,然后分析csd基因的多态
性。我们从广西和海南大蜜蜂体csd基因3区分别获得了34个和24个等位基因,两个体共有52个单倍型,其中有6个等位基因为两个体所共有。
广西体的核苷酸差异π值为0.04889+0.00404而海南体的核苷酸差异π值为0.03832+0.00541,两个体核苷酸没有显著性差异ME分子系统树表明所有来自海南和广西的单倍型在分子系统树上混杂在一起,并没有按照地理来源形成海南和广西两支。将Cho等(2006)和Hasselmann等(2008)所报道的的大蜜蜂序列和本研究获得的序列一起用ME法构建进化树,结果表明所有的大蜜蜂csd等位基因在进化树上混杂在一起,没有按照地理来源分成若干支。
体分析表明海南和广西大蜜蜂体的Fst遗传距离是5.32%,表明两个体间存在弱的遗传分化,同时在两蜂中有很高的基因流,Nm=6.73,暗示着在历史上这两蜂间有频繁的基因交流,所有这些结果表明这两蜂间的遗传分化分化很低。5.浆蜂csd基因的多态性分析对人工选育的王浆产量高的浆蜂和王浆产量低的意大利蜜蜂csd基因的多态性分析,观察人工培育后csd基因的多态性情况。
以浙江人工选育的浆蜂和来自法国的意大利蜜蜂工蜂为实验材料,提取每个工蜂样品的基因组
DNA,对csd基因3区进行PCR扩增、克隆和测序,然后分析csd基因的多态性。对2个体的多态性进行分析表明意大利蜜蜂和浆蜂的核苷酸多样度分别为0.04380±0.00575和0.05785±0.00492。
z检验表明两个体之间的多态性存在显著差异。将两个蜂种所有的单倍型一起用来构建系统树,结果表明来自意大利蜜蜂和人工选育的浆蜂的单倍型混杂在一起,没有形成完全独立的两个分枝。
体分析表明浆蜂和意大利蜜蜂Fst距离是3.69%,说明意大利蜜蜂和人工选育的浆蜂之间的遗传分化很弱。