分子标记遗传图谱的构建
检测出的每个分子标记反映的都是相应染体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离体或衍生系；测定作图体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。
第一节  作图体的建立
要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图体。建立作图体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离体类型的选择及体大小的确定等。
一、亲本的选配
亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的体就可成为理想的RFLP作图体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学S.D.Tanksley实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA多态性非常丰富。第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。第三，要考虑杂交后代的可育性。亲本间的差异过大，染体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低后代的结实率，甚至导致不育，影响分离体的构建。由于各种原因，仅用一对亲本的分离体建立的遗传图谱往往不能完全满足基因组研究和各种育种目标的要求，应选用几个不同的亲本组合，分别进行连锁作图，以达到相互弥补的目的。第四，选配亲本时还应对亲本及其F1进行细胞学鉴定。若双亲间存在相
互易位，或多倍体材料（如小麦）存在单体或部分染体缺失等问题，那末其后代就不宜用来构建连锁图谱。
二、分离体类型的选择
根据其遗传稳定性可将分离体分成两大类：一类称为暂时性分离体，如F2、F3、F4、BC、三交体等，这类体中分离单位是个体，一经自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用。另一类称为永久性分离体，如RI、DH体等，这类体中分离单位是株系，不同株系之间存在基因型的差异，而株系内个体间的基因型是相同且纯合的，是自交不分离的。这类体可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变体的遗传组成，可以永久使用。
构建DNA连锁图谱可以选用不同类型的分离体，它们各有其优缺点，因此应结合具体情况选用。
（一）F2代体
F2体是常用的作图体，迄今大多数植物的DNA标记连锁图谱都是用F2体构建的。不
论是自花授粉植物，还是异花授粉植物，建立F2体都是容易的，这是使用F2体进行遗传作图的最大优点。但F2体的一个不足之处是存在杂合基因型。对于显性标记，将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型。由于这种基因型信息简并现象的存在，会降低作图的精度。而为了提高精度，减小误差，则必须使用较大的体，从而会增加DNA标记分析的费用。
F2体的另一个缺点是不易长期保存，有性繁殖一代后，体的遗传结构就会发生变化。为了延长F2体的使用时间，一种方法是对其进行无性繁殖，如进行组织培养扩繁。但这种方法不是所有的植物都适用，且耗资费工。另一种方法是使用F2单株的衍生系（F3株系或F4家系）。将衍生系内多个单株混合提取DNA，则能代表原F2单株的DNA组成。为了保证这种代表性的真实可靠，衍生系中选取的单株必须是随机的，且数量要足够多。这种方法对于那些繁殖系数较大的自花授粉植物（如水稻、小麦等）特别适用。
（二）BC1体
BC1（回交一代）也是一种常用的作图体。BC1体中每一分离的基因座只有两种基因型，它直接反映了F1代配子的分离比例，因而BC1体的作图效率最高，这是它优于F2体的地方。BC1体还有一个用途，就是可以用来检验雌、雄配子在基因间的重组率上是否存
在差异。其方法是比较正、反回交体中基因的重组率是否不同。例如正回交体为（A×B）×A，反回交体为A×（A×B），则前者反映的是雌配子中的重组率，后者反映的是雄配子中的重组率。
虽然BC1体是一种很好的作图体，但它也与F2体一样，存在不能长期保存的问题。可以用F2中使用的类似方法来延长BC1体的使用时间。另外，对于一些人工杂交比较困难的植物，BC1体也不太合适，因为一是难以建立较大的BC1体，二是容易出现假，造成作图的误差。
顺便一提，对于一些自交不亲和的材料，可以使用三交体，即（A×B）×C。由于存在自交不亲和性，这样的三交体中不存在假现象。
（三）RI体
RI（重组自交系）体是后代经过多代自交而产生的一种作图体，通常从F2代开始，采用单粒传的方法来建立。由于自交的作用是使基因型纯合化，因此，RI体中每个株系都是纯合的，因而RI体是一种可以长期使用的永久性分离体。理论上，建立一个无限大的
RI体，必须自交无穷多代才能达到完全纯合；建立一个有限大小的RI体则只需自交有限代。然而，即使是建立一个通常使用的包含100~200个株系的RI体，要达到完全纯合，所需的自交代数也是相当多的。据吴为人等（1997）从理论上推算，对一个拥有10条染体的植物种，要建立完全纯合的RI作图体，至少需要自交15代。可见，建立RI体是非常费时的。在实际研究中，人们往往无法花费那么多时间来建立一个真正的RI体，所以常常使用自交6~7代的“准”RI体。从理论上推算，自交6代后，单个基因座的杂合率只有大约3%，已基本接近纯合。然而，由于构建连锁图谱时涉及到大量的DNA标记座位，因而虽然多数标记座位已达到或接近完全纯合，但仍有一些标记座位存在较高的杂合率，有的高达20%以上（李维明等2000）。尽管如此，实践证明，利用这样的“准”RI体来构建分子标记连锁图谱仍是可行的。
在RI体中，每一分离座位上只存在两种基因型，且比例为1:1。从这点看，RI体的遗传结构与BC1相似，也反映了F1配子的分离比例。但值得注意的是，当分析RI体中两个标记座位之间的连锁关系时，算得的重组率比例并不等于F1配子中的重组率，这是因为在建立RI体的过程中，两标记座位间每一代都会发生重组，所以RI体中得到的重组率比例是多代重组频率的积累。不过，从理论上可以推算出，RI体中的重组比例（R）与F1配子中的重组
率（r）之间的关系为：R=2r/(1+2r)。因此，用RI体仍然可以估计重组率，亦即RI体仍然可以用于遗传作图。
RI体的优点是可以长期使用，可以进行重复试验。因此它除了可用于构建分子标记连锁图外，特别适合于数量性状基因座（QTL）的定位研究。但是，考虑到构建RI体要花费很长时间，如果仅是为了构建分子标记连锁图的话，选用RI体是不明智的。另外，异花授粉植物由于存在自交衰退和不结实现象，建立RI体也比较困难。
（四）DH体
高等植物的单倍体（Haploid）是含有配子染体数的个体。单倍体经过染体加倍形成的二倍体称为加倍单倍体或双单倍体（DH）。DH体产生的途径很多，亦因物种不同而异，最常见的方法是通过花药培养，即取F1植株的花药进行离体培养，诱导产生单倍体植株，然后对染体进行加倍产生DH植株。DH植株是纯合的，自交后即产生纯系，因此DH体可以稳定繁殖，长期使用，是一种永久性体。DH体的遗传结构直接反映了F1配子中基因的分离和重组，因此DH体与BC1体一样，作图效率是最高的。另外，由于DH体跟RI体一样，可以反复使用，重复试验，因此也特别适合于QTL定位的研究。
DH体直接从F1花粉经培养产生，因而建立DH体所需时间不多。但是，产生DH植株有赖于花培技术。有些植物的花药培养非常困难，就无法通过花培来建立DH体。另外，植物的花培能力跟基因型关系较大，因而花培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏DH体的遗传结构，造成较严重的偏分离现象，这会影响遗传作图的准确性。因此，如果是以构建分子标记连锁图为主要目的的话，DH体不是一种理想的作图体。
三、体大小的确定
遗传图谱的分辨率和精度，很大程度上取决于体大小。体越大，则作图精度越高。但体太大，不仅增大实验工作量，而且增加费用。因此确定合适的体大小是十分必要的。合适体大小的确定与作图的内容有关。大量的作图实践表明，构建DNA标记连锁图谱所需的体远比构建形态性状特别是数量性状的遗传图谱要小，大部分已发表的分子标记连锁图谱所用的分离体一般都不足100个单株或家系。而如果用这样大小的体去定位那些控制农艺性状尤其是数量性状的基因，就会产生很大的试验误差。从作图效率考虑，作图体所需样本容量的大小取决于以下两个方面：一是从随机分离结果可以辨别的最大图距，二是两个标记间可以检测到重组的最小图距。因此，作图体的大小可根据研究的目标来确定。作图
体越大，则可以分辨的最小图距就越小，而可以确定的最大图距也越大。如果建图的目的是用于基因组的序列分析或基因分离等工作，则需用较大的体，以保证所建连锁图谱的精确性。在实际工作中，构建分子标记骨架连锁图可基于大体中的一个随机小体（如150个单株或家系），当需要精细地研究某个连锁区域时，再有针对性地在骨架连锁图的基础上扩大体。这种大小体相结合的方法，既可达到研究的目的，又可减轻工作量。
作图体大小还取决于所用体的类型。如常用的F2和BC1两种体，前者所需的体就必须大些。这是因为，F2体中存在更多种类的基因型，而为了保证每种基因型都有可能出现，就必须有较大的体。一般而言，F2体的大小必须比BC1体大约大一倍，才能达到与BC1相当的作图精度。所以说，BC1的作图效率比F2高得多。在分子标记连锁图的构建中，DH体的作图效率在统计上与BC1相当，而RI体则稍差些。总的说来，在分子标记连锁图的构建方面，为了达到彼此相当的作图精度，所需的体大小的顺序为F2>RI>BC1和DH。
第二节基因多态性  图谱构建的理论基础
一、染体遗传理论
1903年W. S. Sutton和T. Boveri分别提出了遗传因子位于染体上的理论，他们将染体看作是孟德尔基因的物理载体。该理论亦称为Sutton-Boveri染体遗传理论，其基本要点如下：(1)体细胞核内的染体成对存在，其中一条来自雌亲，一条来自雄亲，成对染体的两个成员是同源的。(2)每条染体在个体的生命周期中均能保持其结构上的恒定性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中起着一定的作用。(3)在减数分裂中，同源染体的两个成员相互配对，随后又发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍体性细胞。
二、基因重组和连锁理论
连锁图谱构建的理论基础是染体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染体上的基因相互独立、自由组合，同源染体上的基因产生交换与重组，交换的频率随基因间距离的增加而增大。位于同一染体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起，而表现为基因连锁。它们之间的重组是通过一对同源染体的两个非姊妹染单体之间的交换来实现的。
假设某一对同源染体上存在A-a，B-b两对连锁基因，现有两个亲本P1 和P2，它们的基因型分别为AABB和aabb，两亲本杂交产生AaBb双杂合体。F1在减数分裂过程中应产生4种类型的配子，其中两种为亲型配子AB和ab，两种为重组型配子Ab和aB。由于A-a和B-b位于同
一染体上，要产生重组型配子必须在这两个基因的连锁区段上发生交换。重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的比例越大。重组型配子最大可能的比例是50%，这时在所有减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为独立遗传。