孕期营养不良对宫内发育迟缓大鼠心肌重构的影响
黎　明， 何忠开， 黄石安， 陈建英， 梁　政， 吴小玲， 陈　灿
广东湛江 524001）
摘　要：目的 观察孕期营养不良对宫内发育迟缓(IUGR)大鼠心肌重构的影响。 方法 6只SD雌性大鼠随机分成正 常对照组和 IUGR组，每组3 只。采用妊娠全期饥饿法建立 IUGR动物模型，分别有16只正常仔鼠和 16只 IUGR仔鼠纳入实 验对象。仔鼠3周时断乳，16周时测定各组仔鼠左心室重量指数(LVMI)，免疫组化法检测心肌I 型和III 型胶原表达。 结 果 与正常仔鼠相比，IUGR仔鼠出生时平均体质量和身长明显落后( P<0.01)。给予正常饮食后， IUGR仔鼠出生后呈现 追赶生长现象，并于第15周赶上正常对照组体质量水平。IUGR组仔鼠的LVMI 较正常对照组明显增大(P<0.05)，其心肌I 型和III 型胶原表达量均显著增高 (P<0.01) 。结论 孕期营养不良可导致 IUGR仔鼠心肌发生重构，出生后正常饮食亦未 能干预心肌重构的发生和发展。 关键词：营养不良；宫内发育迟缓；心肌重构；大鼠 中图分类号：R 541 文献标识码： A 文章编号：1005-4057(2012)05-0484-04 ＤＯＩ： 10.3969/j.issn.1005-4057.2012.05.003
（广东医学院附属医院心内科，
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｍａｌｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｎ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｒａｔｓ
LI Ming, HE Zhong-kai, HUANG Shi-an, CHEN Jian-ying, LIANG Zheng, WU Xiao-ling, CHEN Can
(Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Objective To investigate the influence of gestational malnutrition on myocardial remodeling of intrauterine growth retardation (IUGR) rats. Methods Six SD female rats were randomly divided into control group and IUGR group. The IUGR animal model was established by whole term maternal nutrition restriction. There were 16 normal and 16 IUGR newborn rats in the experiment. The newborn rats were weaned 3 weeks after birth, and their left ventricular mass index (LVMI) was measured, and expression of collagen I and III was assessed by immunohistochemistry at 16 weeks of age. Results Compared with control group, average body weight and length decreased in IUGR group (P<0.01). After fed normal diet, IUGR rats showed a catch-up growth phenomenon and their body weight came up to that of control group at 15 weeks of age. LVMI and expression of myocardial collagen I and III were significantly higher in IUGR group than those in control (P<0.01 or 0.05). Conclu
sion Gestational malnutrition leads to myocardial remodeling of IUGR rats. Postnatal normal nutrition is unlikely to prevent the development and progression of cardiac remodeling in IUGR rats. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： malnutrition; intrauterine growth retardation; cardiac remodeling; rat
胎 儿 宫 内 发 育 迟 缓 (intrauterine growth retardation, IUGR)又称胎儿生长受限，是指出生胎儿质量 与同胎龄胎儿相比质量均数减少2个标准差及以上， 是围产期主要并发症之一。1986年，Barker等 在全 英格兰和威尔士的一项流行病学调查中发现，生活 水平较差的西北部地区的成人心血管病患病率比富 裕的东南部高, 而且同该地区早于该段时期的新生儿
基金项目： 广东省第二批产业技术与开发资金计划项目      (No. 2007B031508002) 收稿日期： 2012-05-03；修订日期：2012-09-17 作者简介： 黎　明(1984－ )，男，硕士，住院医师。
[1]
死亡率成正比，于是提出了心脑血管疾病的“胎儿 起源”假说。近年来，越来越多的研究也证实了此 观点
[2-4]
。目前国内对母体营养不良造成胎儿
IUGR发生的研究报道较少，本研究主要通过孕鼠妊 娠全期饥饿法制作IUGR动物模型，探讨其心肌的变 化，了解IUGR大鼠心脏重构发生的情况，为干预其 心肌重构的发生和发展提供实验基础和理论依据。 1　资料和方法 1.1　IUGR动物模型的建立和分组 18只清洁级 Sprague-Dawlew(SD)大鼠(广东医学
院实验动物中心提供 )，其中雌性无交配史 6只，雄 性12只，平均体质量为(230.0± 20.0) g。将6只 SD 雌 性大鼠，随机分为正常对照组和IUGR组，各 3只。 两组于每天下午6～ 7时做阴道涂片，将处于发情期 的雌鼠与雄鼠按1: 2随机合笼1晚，次日晨8 ～9时进 行阴道涂片检测，以阴道栓或者光学显微镜下观察 发现精子时作为妊娠第1日，孕鼠单笼喂养。自妊娠 第1天起，正常对照组孕鼠饲以标准饲料，每日进食 饲料量均为 25 g； IUGR组给予正常对照组40%的进 食量，即10 g，普饮，直至分娩当天。IUGR判断标 准：新生鼠出生体质量低于正常对照组出生平均体 质量 2个标准差者为 IUGR鼠 。分娩后测量各组仔 鼠出生时体质量和身长，每只母鼠带仔量为 5～ 6 只，雌雄各半，多余舍去，母乳喂养。最后分别有 16只正常对照组仔鼠和16只IUGR组仔鼠纳入实验对 象。母鼠常规饲料喂养。仔鼠3周后断乳分笼喂养， 仔鼠体质量未超过100 g时均给予5 g标准饲料喂养； 而体质量大于100 g但未超过200 g时给予 10 g标准饲 料喂养，依此类推，直至 16周，每周称量仔鼠的体 质量。 1.2　心肌组织标本的留取 第16周时，用5%水合氯醛溶液麻醉仔鼠，开胸 迅速取出心脏，用消毒无菌 PBS清洗心脏内积血， 滤纸吸干后，再分离出心房、右心室和左心室(加室 间隔 )组织，称取左心室(加室间隔 )的质量为左心室 2 质量 (mg)。取左心室心肌组织5 mm 浸入 10%中性福 尔马林中固定；分离出约 100 mg左心室心尖部心肌 组
织，将尖部心肌组 织和剩余心肌组织放入冻存 管，置入液氮中冷冻，再转至－80℃冰箱保存。 1.3　免疫组化方法检测心肌组织I型、III 型胶原的表 达量 取10%中性福尔马林固定的心肌组织按程序制 作成蜡块，切片厚度 4 μ m，封闭液为正常山羊血 清，一抗分别为I 型、 III 型胶原抗体(1:50 ，北京中 杉金桥生物技术有限公司)，二抗为通用型辣根过氧 化物酶标记(SP)抗体(北京中杉金桥生物技术有限公
[2]
司)，参照试剂盒操作步骤进行染，DAB显，复 染后封片。运用 Image-pro plus 6.0软件进行图像定 量分析，分别测量细胞浆内或者间质中棕黄颗粒 的 平 均 灰 度 值 (GA)、 该 阳 性 区 域 的 背 景 灰 度 值 (GB)和阳性细胞在该区域的面积密度 (AAB)，照相 设 备 的 最 大 灰 度 分 级 Gmax为 255， 计 算 阳 性 单 位 (PU值)，公式如下：
1.4　统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件进行分析与处理，计量 资料以( ±s) 表示，采用 t 检验，以P<0.05为差异有 统计学意义。 2　结果 2.1　两组仔鼠体质量、身长和LVMI的比较 IUGR组仔鼠出生时的体质量和身长均显著落后 于正常对照组[(5.06±0.41) vs (7.24± 0.79)、 (4.93 ± 0.20) vs (5.61±0.28)] ，差异有统计学意义(P<0.05)。 给予正常饮食后，IUGR组的体质量呈现追赶生长现 象，第 9周时体质量达(103.88±13.05) g，与正常对 照 组 (109.00± 9.77) g 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0.05)；于第 10周增加饲料后， IUGR组的体质量 重新落后于正常对照组并再次呈现追赶生长现象， 于第15周时其
体质量为(175.88±17.77) g，再次追赶 上正常对照组(180.13±21.38) g(P>0.05)，详见图1。 第16周龄(成年)时，IUGR组仔鼠的LVMI明显高于正 常对照组，差异有统计学意义(P<0.05) ，详见表1。
2.2　心肌I型、III型胶原的表达 免疫组织化学染检测的阳性结果为心肌细胞 胞浆或者间质中出现黄颗粒，见图1和图 2。运用 Image-pro plus 6.0软件进行图像定量分析，计算阳
威尔士和英格兰的关系
性单位即PU值示：IUGR组仔鼠心肌I 型胶原和III 型 胶原的表达均比正常对照组高，差异有统计学意义 (P<0.01)，详见表2。
1A
1B
2A
2B
重构的程度 [10]。研究提示，孕期营养不良可以导致 心脏早期的结构改变
[11-13]
。
本研究采用孕鼠妊娠全期饥饿法建立IUGR动物 模型，通过观察 IUGR仔鼠出生后体质量、身长、 LVMI、I 型和III 型胶原的变化研究孕期营养不良对 IUGR仔鼠心肌重构的影响。结果发现，与正常对照 3　讨论 在“胚胎学说”提出不久，Lucas 也提出了营 养程序化的概念，即在发育的关键或敏感时期的营 养状况，将对机体或各器官功能产生长期以至终生 的影响。其机制是由于早期营养环境刺激机体产生 适应性的克隆选择或者分化母细胞增殖，从而使组 织细胞数量或比例永久性的改变。现在许多研究提 示：冠状动脉粥样硬化、高血压、高血脂和糖尿病 等病变不仅与遗传、饮食、行为、环境等因素有 关，也可能是“贫穷病”，是胎儿发育时期宫内营 养不良造成的
[6-8] [5]
组相比，IUGR组仔鼠出生时的平均体质量和平均身 长显著落后；出生后给予正常饮食后，IUGR仔鼠的 平均体质量呈现出追赶生长现象，这与文献报道相 一致
[14-15]
，并于第15周时追赶上正常对照组水平。
成年后(即16周时)，IUGR组仔鼠LVMI较正常对照组 明显增大；其心肌I型胶原和III型胶原的表达均比正 常对照组高，差异有统计学意义。这说明IUGR 组仔 鼠心肌细胞中Ⅰ/ III型胶原纤维比值发生了改变，存
在心肌重构现象。因此，我们推测孕期营养不良可 导致IUGR仔鼠心肌重构的发生，而 IUGR仔鼠恢复 正常饮食后，体质量能达到正常水平，但是未能很 好地干预其心肌重构的发生和发展。 参考文献：
[1] Barker D J, Osmond C. Infant mortality, childhood nutrition, and ischaemic heart disease in England and Wales [J]. Lancet, 1986, 1(8489): 1077-1081. [2] 慧明 , 毛萌. 食物限制法建立宫内发育迟缓模型及对其重 要器官的影响 [J]. 实用儿科临床杂志, 2006, 21(19):13331335. [3] Battista M C, Calvo E, Chorvatova A, et al. Intra-uterine growth restriction and the programming of left ventricular remodelling in female rats [J]. J Physiol, 2005, 565(1):197205. [4] Yi X, Sarah J W, Darryl O’Brien, et al. Hypoxia or nutrient
。
心肌重构主要是指在病理条件下，心脏心肌组 织发生的一系列的由分子和细胞机制引起的细胞结 构、功能和遗传表型的异常，临床表现为心肌细胞 坏死、凋亡、萎缩等病理改变及细胞外间质的变 化。而细胞外间质的重构主要是I型和III 型胶原的重 构 。成年人心脏间质胶原分为 I、III、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ 型，其中Ⅰ型胶原占胶原总量的80%～ 85%，其伸 展和回弹性较小，而僵硬度较大，主要聚合成粗纤 维 ； III型 胶 原 纤 维 约 占 11%， 其 伸 展 和 回 弹 性 较 大，形成典型的细纤维。故少量的I 型胶原增加即可 增加心肌的僵硬度，而III 型胶原明显增加则可提高 心室的顺应性，胶原表型的改变对舒张功能的影响 比胶原的总量更重要，所以 I/III 型比值可反映心肌
[9]
restriction during pregnancy in rats leads to progressive cardiac remodeling and impairs postischemic recovery in adult male offspring [J]. FASEB J, 2006, 20(8):1251- 1253. [5] Lucas A. Programming by early nutrition:an experimental approach [J]. Nutr, 1998, 128 (Suppl 2):401S-406S. [6] Frankel S, Elwood P, Sweetnam P, et al. Birth weight, adult risk factors and incident coronary heart disease:the Caerphilly study [J]. Public Health, 1996, 110(3):139-143. [7] Rich-Edwards J W, Colditz G A, Stampfer M J, et al. Birth weight and the risk for type 2 diabetes mellitus in adult women [J]. Ann Intern Med, 1999, 130(4 Pt 1): 278-284. [8] Lingohr M K, Buettner R, Rhodes C J. Pancreatic β -cell growth and survival: a role in obesity-linked type 2 diabetes? [J]. Trends Mol Med, 2002, 8(8): 375-384. [9] Weber K T, Sun Y, Katwa L C. Connective tissue： a metabolic entity[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995, 27(1):107-120. [10] 曾欣, 张元春. 心脏胶原纤维增生及其影响因素 [J]. 心血
管病学进展, 2003, 24(4), 303-306. [11] Han H C, Austin K J. Maternal nutrient restriction alters gene expression in the ovine fetal heart [J]. Physiol, 2004, 558 (Pt1):111-121. [12] Corstius H B, Zimanyi M A. Effect of intrauterine growth restriction on the number of cardiomyocytes in rat hearts [J]. Pediatr Res, 2005, 57(6):796-800. [13] Lim K, Zimanvi M A, Black M J, et al. Effect of maternal protein restriction in rats on cardiac fibrosis and capillarization in adulthood [J]. Pediatr Res, 2006, 60 (1):83-8
7. [14] 陈兆文, 李伟华. 200例0～2岁宫内发育迟缓儿的生长方式 分析 [J]. 上海医学, 2005, 28(2):122-125. [15] 丘小汕, 黄婷婷. 早期不同饮食营养干预对宫内生长迟缓 幼 鼠 生 长 追 赶 的 影 响 [J]. 中 华 儿 科 杂 志 , 2004, 42(10): 782-784.
(上接第483页 )
3　讨论 民间使用野牡丹肠炎、痢疾、肝炎、衄 [1-2] 血、便血，叶捣碎外敷或用干粉止血等 。血栓形 成和血小板聚集在生理止血过程中起重要作用。直 流电刺激大鼠的颈动脉损伤 血管内皮，造成一系列 活性因子的释放，激活血小板和白细胞，引起血小 板 聚 集 ， 快 速 形 成 混 合 型 血 栓 。 cAMP、 cGMP 和 NO在 血 小 板 聚 集 过 程 中 起 重 要 的 调 节 作 用 ， cAMP和NO生成减少能够促进血小板聚集，反之则 抑制血小板聚集 。 本实验结果显示，野牡丹提取物5mg/kg及生理 盐 水 组 的 5 min血 栓 平 均 堵 塞 率 分 别 为 (86.56± 1.54)% 及 (63.15± 9.74)% ，提示野牡丹提取物有促 进血栓形成的作用。野牡丹提取物 200、 400、 800 mg/L及凝血酶500 U/mL、生理盐水组血小板最大聚 集 率 分 别 为 (0.75± 0.50) 、 (5.75± 1.71) 、 (11.00± 2.58)、(13.25±2.99)、 0Ω，野牡丹提取物400、 800 mg/L及凝血酶500 U/mL与生理盐水组比较差异均有 统计学意义，提示野牡丹提取物具有凝血酶类似的 作 用 ， 可 诱 导 血 小 板 聚 集 。 野 牡 丹 提 取 物 200、 400、 800 mg/L组血小板cAMP、 cGMP和 NO水平与 生 理 盐 水 组 比 较 差 异 均 有 统 计 学 意 义 ， 尤 以 800
[4-5]
mg/L组 为 著 ， 提 示 野 牡 丹 提 取 物 可 降 低 血 小 板 cAMP、 cGMP和 NO 的水平，其机理值得进一步探 讨。 本实验的结果表明，野牡丹具有促进血栓形成 和 血 小 板 聚 集 的 作 用 ， 能 够 降 低 血 小 板 cAMP、 cGMP和 NO 的水平。我们推测，野牡丹止血的机理 可能是野牡丹降低血小板cAMP水平，同时降低血小 板 cGMP水平，通过 cGMP-蛋白激酶途径减少 NO的 生成，两者同时促进血小板的聚集，形成血栓来栓 塞血管，从而加强止血的作用。 参考文献：
[1] 常章富, 吴嘉瑞, 滕云霞 , 等. 中国野牡丹科药用植物性能主 治的研究 [J]. 中国中药杂志 , 2008, 33(7): 854-859. [2] 刘慧 , 符 健 . 野牡丹的研究进展 [J]. 中医药导报 , 2008， 14(12): 90-91. [3] 陈奇 . 中药药理研究方法学 [M]. 2版. 北京 ：人民卫生出版社, 1993: 68-69. [4] 丁顺 , 李贺, 范新田 . 脱氢紫堇碱体外对兔血小板中环核苷 酸含量的影响 [J]. 中国民康医学 , 2007, 19(3): 165-166. [5] 李满生 , 颜春鲁 , 徐厚谦 . 一氧化氮的脑血管作用研究进展 [J]. 实用老年医学 , 2005, 19(3): 162-163.