中国核酸质谱应用专家共识（最全版）核酸结果查询平台
基因检测在遗传性、感染性及肿瘤等疾病的辅助诊断、用药指导等方面起到举足轻重的作用。该领域检测方法众多，不同技术的优势及不足明显。例如：荧光定量PCR检测速度快，但是通量有限，无法方便快捷地满足临床对于多基因的数十个至数百个位点检测的需求，而高通量测序虽然通量极高，但其成本、耗时、人员需求等也不适用于此类检测。因此，亟需新的技术平台来填补该项空白。
20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统[1,2]，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究[3]，极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展，并且给生物领域及医学领域带来了革命性的突破，由此其奠基人田中耕一和约翰贝内特芬恩于2002年获得诺贝尔化学奖，美国食品药品监督管理局(FDA)于2014年批准MALDI-TOF MS可用于临床核酸检测。本共识将通过介绍MALDI-TOF MS的原理、基因检测原理及应用等方面内容，提高该平台在中国临床实验室中的认知程度。
一、MALDI-TOF MS原理
质谱技术的基本原理是通过样品离子化，产生不同质荷比的离子，然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分子量，并按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。质谱仪器平台虽然种类众多，但可以通过样品进样方式、离子源、质量分析器等方面进行简易分类。其中，MALDI-TOF MS采用的是样品与基质混合进样，激光解吸方式电离以及飞行时间方法进行质量分析。目前仪器灵敏度达到500 fmol，采用标准样品牛血清白蛋白(BSA)进行测定，分辨率达到50以上。
1．基质：
MALDI-TOF MS需要基质参与电离的过程，基质多为具有很强激光能量吸收能力的有机酸，其主要作用为增强样品对激光的吸收，并在一定程度上降低激光对样品的破坏。基因检测所选用的基质通常为羟基吡啶甲酸(HPA)[4]。
2．离子源工作原理：
样品与基质混合结晶后，在激光的照射下基质迅速蒸发，基质和样品分子间的作用力快速削弱，使得样品分子被释放出来。同时，基质可将吸收到的激光能量传递至样品分子并使其电
离。因此，MALDI技术属于光子激发的表面解吸离子源，其能量由激光的光子提供[5]。另外，MALDI电离技术灵敏度极高，仅需pmol～fmol级别的微量样本即可进行检测。
3．飞行时间质量分析器(TOF MS)原理：
飞行时间质量分析器最早出现于1955年，20世纪80年代后期开始快速发展，并常与MALDI离子源联用。其原理是通过间歇式的脉冲电场对离子化的样品进行加速，然后不同分子量的离子在真空飞行管内以各自不同的恒定速度飞向离子检测器。由于真空管内离子飞行速度与其质荷比(m/z)的平方根成反比，不同质荷比的离子到达检测器的飞行时间不同，从而可以区分出样品中具有不同分子量的物质。理论上，TOF分析器的相对分子质量检测范围为0至无限大，但在实际基因检测应用中该检测范围多限制在1 000～10 000区间[6]。
早期的TOF MS分辨率较低，主要原因是当时所采用的离子连续引出技术存在缺陷，即同时离开离子源的相同m/z离子间的动能存在差异[6]。后续Wiley和Mclaren[7]在20世纪50年代开发了延迟引出(DE)技术，离子化后的样品首先进入无场区，然后在几百纳秒或几微秒的延迟后加上电压脉冲引出离子，纠正了具有相同质荷比离子的能量离散，增强了TOF分析器的分辨率。但是，延迟引出的方式每次只能对分子量相对较低的部分进行优化，对高质量区无效，
因此Mamyrin和Shmikk[8]提出了另一种采用反射器提高分辨率的方法。该方法通过引入一个迟滞场可以偏转离子并将其送回飞行管中，该迟滞场位于与离子源相对的自由场的后面，并将检测器设置在迟滞场的一侧用于捕获被反射的离子。反射器可以修正相同质荷比离子的动能偏差，使得不同动能的离子在同一时间到达检测器，从而达到提高分析器的分辨率的效果。与延迟引出技术的弱点相比，反射器对高质量区离子同样可以进行优化，但代价是损失灵敏度和缩小质量范围。由于基因检测多集中于1 000～10 000区间，属于低质量区，因此检测时主要采用带有延迟引出技术的线性模式。
二、基因检测
1．单核苷酸多态性检测：
单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，且这些变异在人中所占比例>1%[9]。单核苷酸多态性在遗传疾病的诊断和筛查以及用药种类及剂量指导等方面有着极其重要的作用。目前，临床最为常用的SNP检测手段主要为Sanger测序、荧光定量PCR、低密度基因芯片和焦磷酸测序等，这些技术大大推动了基因检测在临床医学中的应用。但是，随着人们对疾病机制和手段不断深入的研究，临床对SN
P检测的需求正在从单基因的有限几个位点(如氯吡格雷用药指导的CYP2C19 *2*3两个位点检测[10])逐步转移至多基因多位点(如耳聋基因检测涉及4个基因20个位点)[11]。所以，虽然上述现有临床常用基因检测技术在实验操作、TAT时间、成本、数据分析难易度等方面各有利弊，但总体来说并不完全适合多基因多位点的检测需求。相比之下，MALDI-TOF MS利用多重PCR技术，即1个反应管可同时检测多个SNP位点(最大可同时检测52个位点)[12]，可极大的提高多基因多位点的检测效率以及降低样本用量，满足临床新的需求。
质谱SNP检测主要基于PCR和单碱基延伸技术，其原理是首先通过PCR引物对含待检SNP的目标片段进行扩增[13,14,15]，PCR结束后加入虾碱性磷酸酶(SAP)去除反应液中的dNTP[16,17]。然后在反应液中加入SNP延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中SNP延伸引物可与待测SNP的5′端序列结合并延伸一个碱基，根据不同的SNP模板可得到不同的延伸产物。例如，SNP位点模板为胞嘧啶(C)，则延伸鸟嘌呤(G)，SNP模板为腺嘌呤(A)，则延伸胸腺嘧啶(T)[18]。该步骤完成后，反应液与树脂混合进行离子交换用于去除液体中吸附于DNA片段上的K＋、Na＋、Mg2＋等离子，防止其干扰质谱检测结果。最后，反应液与基质在靶板上结晶，进行质谱检测并得到图谱[19]。由于各延伸产物分子量不同，因此可以在各自的分子量位置查看是否出现检测峰，然后判断该样品的SNP分
型。例如，若在检测结果的图谱中可分别看到G和T的检测峰，则该样品为G/T杂合型，若在结果中只有G检测峰或T检测峰，则相对应的SNP结果为GG纯合或TT纯合型。质谱平台特异性良好，使用国际通用标准品能达到30 ppm，最低检测限为5 ng基因组DNA，对比试验选择的金标准验证技术为Sanger测序技术和同类型获批的检测产品，符合性均为100%。