(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
核酸结果查询
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010256645.7
(22)申请日 2020.04.02
(71)申请人 苏州大学
地址 215123 江苏省苏州市工业园区仁爱
路199号
申请人 上海市计划生育科学研究所
(72)发明人 戴建锋 陈志强 陈静 吴奇涵 
倪晓华 
(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务
所(普通合伙) 11350
代理人 汤东凤
(51)Int.Cl.
G01N  33/68(2006.01)
G01N  33/569(2006.01)
G01N  33/53(2006.01)
(54)发明名称
一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-
CoV-2 N蛋白的方法
(57)摘要
本发明公开了一种采用核酸适配体检测新
冠病毒SARS -CoV -2 N蛋白的方法,核酸适配体为
N  Aptamer  1、N  Aptamer  2或N  Aptamer  3,不仅
能特异性结合SARS -CoV -2病毒N蛋白,还能特异
性的检测出稀释于人血清中的N蛋白和蛋白电泳
样品中的N蛋白。通过上述方式,本发明不需进行
核酸提取或依赖抗体进行检测,同时具有与靶标
分子亲和力强、特异性高、易于制备、免疫原性和
毒性低、化学结构稳定等优势,为早期检测2019
SARS -CoV -
2病原体创造了条件。权利要求书1页  说明书6页序列表1页  附图8页CN 111693712 A 2020.09.22
C N  111693712
A
1.一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS -CoV -2N蛋白的方法,其特征在于,所述核酸适配体能特异性结合SARS -CoV -2病毒N蛋白,所述核酸适配体为N  Aptamer  1、N  Aptamer  2或N  Aptamer  3,N  Aptamer  1的序列为
5-bio -GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCA AAAGTGCACGCTACTTTGCTAA -3;
N  Aptamer2的序列为
5-bio -GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCA AAAGTGCACGCT -3;
N  Aptamer  3的序列为
5-bio -GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGT -3。
2.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS -CoV -2N蛋白的方法,其特征在于,所述核酸适配体采用单链DNA化学合成的方法合成,5‘端加生物素标记。
3.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS -CoV -2N蛋白的方法,其特征在于,所述核酸适配体结合SARS -CoV -2N蛋白的下限达到10ng/ml以下。
4.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS -CoV -2N蛋白的方法,其特征在于,所述核酸适配体能特异性的检测出稀释于人血清中的N蛋白。
5.根据权利要求1所述的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS -CoV -2N蛋白的方法,其特征在于,所述核酸适配体能特异性检测出蛋白电泳样品中的N蛋白。
权 利 要 求 书1/1页CN 111693712 A
一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药应用技术领域,特别是涉及一种采用核酸适配体检测 新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法。
背景技术
[0002]此次新冠病毒以高传染性和强致病性迅速在全球范围内引起新 冠肺炎大流行,对人类健康和社会经济造成严重威胁。对疑似病例进 行快速且准确地诊断,有效隔离感染者并实施积极,是疫情防治 的重要基础。
[0003]目前,应用于病毒学诊断的常规方法包括:1、病毒分离与培养(病毒的特 性、形态、染及生化鉴定,金标准);2、免疫学技术(以血清学和免疫化学 方法检测携带病毒情况);3、分子生物学技术(核酸分子杂交、PCR、核酸测序 等)。
[0004]但各检测方法都有其缺点:1、病毒分离与培养:病毒的分离培养与鉴定是 病毒诊断的金标准,但其方法繁杂,对技术、设施要求高,需时较长,目前临 床实验室广泛开展存在困难;2、免疫学技术:目前,新版临床指南指出,患者 新冠病毒特异性IgM在发病后3~5天开始检出。IgG则更晚,在10-21天开始出 现,在恢复期才会有4倍升高,因此该方法仅能用于疾病中晚期诊断,并且由 于抗体检测方法学上的原因,其检测结果准确性不高,假阴和假阳的结果都有 可能产生;3、分子生物学技术-核酸检测:据报道,新冠病毒核酸检测的假阴性 比例最高可达30-50%,同时,试剂盒检测结果不仅与试剂盒质量、检测上下限 有关,还受新冠病毒自身的特点、采样部位、采样量、运输和储存环节,以及 实验室检测条件和人员操作等因素的影响。
[0005]此前,我国及韩国科学家均有报道,在SARS发病的早期(1~10天),血清 中的病毒N蛋白检测比血清中病毒核酸和抗体检测更加灵敏。因此,血清中病 毒N蛋白是一个非常好的病毒检测指标,能够与核酸检测、抗体检测、CT检测 相互印证,成为新冠肺炎排查的重要手段。
[0006]核酸适配体(Aptamer)是一段寡核苷酸序列(DNA或RNA),是新诊断方 法和药物研究的热点之一。核酸适体有诸多优势:与靶标分子亲和力强,特异 性高;易于制备,可在体外筛选,可高通量获得;免疫原性和毒性低;化学结 构稳定等等,因此被广泛应用于生物检测领域。
[0007]传统的抗原-抗体反应灵敏度和特异性均较好,酶联免疫反应在各种生物分 子的探测中发挥着举足轻重的作用,市场上的许多试剂盒就是基于此原理开发 的。但蛋白质作为探针分子,易受pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价 格昂贵,适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA),比蛋白质体积更小,经 SELEX筛选富集后,可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度,同时合成更容 易,稳定性更好。韩国科学家已报道了一种能够特异性结合SARS病毒N蛋白 的单链DNA适配体,并推测其可用于病毒N蛋白的检测。我们经过生物信息学 比对,发现2003年SARS病毒与2019年新冠肺炎病毒SARS-CoV-2的N蛋白 有91~94%的蛋白同源性;分子结构模拟也推测,SARS-CoV-2的N蛋白与SARS 的N蛋白有相似的3D分子结
构。因此,本发明将研究基于单链DNA核酸适配 体的新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白检测方法。
发明内容
[0008]本发明主要解决的技术问题是提供一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法,具有在新冠病毒感染的早期血清学诊断的应用前 景。
[0009]为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:提供一种采用核酸 适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法,所述核酸适配体能特异性结 合SARS-CoV-2病毒N 蛋白,所述核酸适配体为N Aptamer 1、N Aptamer 2或N Aptamer 3,N Aptamer 1的序列为[0010]5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGTCGTG CAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3;
[0011]N Aptamer2的序列为
[0012]5-b i o-G C A A T G G T A C G G T A C T T C C G G A T G C G G A A A C T G G C T A A T T G G T G A G G CTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCT-3;
[0013]N Aptamer 3的序列为
[0014]5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGT-3。[0015]在本发明一个较佳实施例中,所述核酸适配体采用单链DNA化学合成的方 法
合成,5‘端加生物素标记。
[0016]在本发明一个较佳实施例中,所述核酸适配体结合SARS-CoV-2 N蛋白的 下限达到10ng/ml以下。
[0017]在本发明一个较佳实施例中,所述核酸适配体能特异性的检测出稀释于人 血清中的N蛋白。
[0018]在本发明一个较佳实施例中,所述核酸适配体能特异性检测出蛋白电泳样 品中的N蛋白。
[0019]本发明的有益效果是:本发明的采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法,核酸适配体可以特异性结合2019 SARS-CoV-2病毒N蛋白,不 需进行核酸提取或依赖抗体进行检测,同时具有与靶标分子亲和力强、特异性 高、易于制备、免疫原性和毒性低、化学结构稳定等优势,为早期检测2019SARS-CoV-2病原体创造了条件。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下, 还可以根据这些附图获得其它的附图,其中:
[0021]图1是本发明SARS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白的同源性比对结果图;
[0022]图2是本发明核酸适配体中N Aptamer 1核苷酸序列的二级结构图;
[0023]图3是本发明核酸适配体中N Aptamer 2核苷酸序列的二级结构图;
[0024]图4是本发明核酸适配体中N Aptamer 3核苷酸序列的二级结构图;
[0025]图5是本发明核酸适配体中核苷酸序列的二级结构图;
[0026]图6是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法中 SARS-
CoV-2 N蛋白、S蛋白和3CLpro蛋白的表达与纯化图;
[0027]图7是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法的过 程图;[0028]图8是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法的结 果示意图;
[0029]图9是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法中特 异性检出人血清中N蛋白的结果示意图;
[0030]图10是本发明采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法中 适配体用于蛋白印迹实验的结果示意图。
具体实施方式
[0031]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描 述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 它实施例,都属于本发明保护的范围。
[0032]一、SARS与SARS-CoV-2的N蛋白的同源性分析
[0033]利用生物信息学方法,经过生物信息学比对,发现2003年SARS病毒与2019 年新冠肺炎病毒SARS-CoV-2的N蛋白有91%的蛋白同源性。分子结构模拟也 推测,SARS-CoV-2的N 蛋白与SARS的N蛋白有相似的3D分子结构。 SARS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白的同源性比对结果如图1所示。
[0034]二、ssDNA N Aptamer设计与合成
[0035]将ssDNA aptamer 1(命名为N aptamer 1)用于2019的SARS-CoV-2的N 蛋白检测。在此基础上,以针对SARS-CoV N蛋白的Aptamer(N Aptamer 1) 序列为基础,改造了该核酸适配体,合成了更短的核酸适配体N aptamer 2和N aptamer 3。并验证了上述三个核酸适配体与SARS-Cov 2的N蛋白的结合特性。 其中,ssDNA aptamers采用常规单链DNA化学合成的方法合成,5‘端加生物 素(biotin)标记。
[0036]N Aptamer 1核苷酸序列为:
[0037]5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGTCGTG CAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3;
[0038]化学合成的适配体用无菌水稀释到工作浓度100nM溶液以后,进行预处理:90度热变性10分钟,然后立即放冰里10分钟,让其形成二级结构。形成的二 级结构如图2所示。[0039]N Aptamer 2核苷酸序列为:
[0040]5-b i o-G C A A T G G T A C G G T A C T T C C G G A T G C G G A A A C T G G C T A A T T G G T G A G G CTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCT-3;
[0041]预处理后,可形成如图3所示的二级结构。
[0042]N Aptamer 3核苷酸序列为:
[0043]5-bio-GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGG CTGGGGCGGT-3;[0044]预处理后,可形成如图4所示的二级结构。
[0045]此外,为了证明核酸适配体的特异性,合成了一个阴性对照适配体(Aptamer negative ccontrol,),核苷酸序列为:5-bio- GCAATGGTACG

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