(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010074366.9
(22)申请日 2020.01.22
(71)申请人 武汉友芝友医疗科技股份有限公司
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新二路388号光谷国际生物医
药企业加速器1.2期23栋1单元4、5层
(72)发明人 方闪闪　梁瑶　李丽琼　张喆　
蔡从利　
(74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务
所(特殊普通合伙) 11463
代理人 周文波
(51)Int.Cl.
C12Q  1/6883(2018.01)
C12Q  1/6858(2018.01)
C12N  15/11(2006.01)
(54)发明名称
基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相
关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法
(57)摘要
本发明公开了一种基于核酸质谱技术检测
心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒
和检测方法，涉及基因检测技术领域。本发明公
开的核酸组合物包括用于进行多重PCR扩增心血
管疾病用药相关基因的扩增引物组以及用于进
行单碱基延伸反应的延伸引物组。使用本发明提
供的核酸组合物、试剂盒或检测方法，采用核酸
质谱技术可以检测心血管疾病用药相关基因的
16个位点的基因型，其具有灵敏度高，特异性强，
结果易于识别，并提高了准确性，操作方便等特
点，本发明为心血管疾病用药相关基因的检测提
供了更为可靠的检测手段，也为心血管疾病的个
体化用药提供了更为合理的用药指导。权利要求书2页  说明书21页序列表8页  附图10页CN 111118145 A 2020.05.08
C N  111118145
A
1.一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物，其特征在于，其包括用于进行多重PCR扩增心血管疾病用药相关基因的扩增引物组以及用于进行单碱基延伸反应的延伸引物组；
其中，所述扩增引物组包括如下引物对：
第1引物对：其包括SEQ ID NO.1-2所示的引物；
第2引物对：其包括SEQ ID NO.3-4所示的引物；
第3引物对：其包括SEQ ID NO.5-6所示的引物；
第4引物对：其包括SEQ ID NO.7-8所示的引物；
第5引物对：其包括SEQ ID NO.9-10所示的引物；
第6引物对：其包括SEQ ID NO.11-12所示的引物；
第7引物对：其包括SEQ ID NO.13-14所示的引物；
第8引物对：其包括SEQ ID NO.15-16所示的引物；
第9引物对：其包括SEQ ID NO.17-18所示的引物；
第10引物对：其包括SEQ ID NO.19-20所示的引物；
第11引物对：其包括SEQ ID NO.21-22所示的引物；
第12引物对：其包括SEQ ID NO.23-24所示的引物；
第13引物对：其包括SEQ ID NO.25-26所示的引物；
第14引物对：其包括SEQ ID NO.27-28所示的引物；
第15引物对：其包括SEQ ID NO.29-30所示的引物；
第16引物对：其包括SEQ ID NO.31-33所示的引物；
所述延伸引物组包括SEQ ID NO.34-49所示的引物。
2.一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的核酸组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多重PCR预混液；
优选地，所述扩增引物组存在于所述多重PCR预混液中；
优选地，所述多重PCR预混液中还含有：UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR预混液中还含有Mg2+；
优选地，所述Mg2+以MgCl2的形式添加至所述多重PCR预混液中。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR预混液中还含有DMSO。
6.根据权利要求3-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR预混液中含有PCR 缓冲液和DNA聚合酶；
优选地，所述DNA聚合酶选自如下聚合酶中的一种：Taq、Tac、Sso、Poc、Bst、Tne、Tma、Pab、Tih、Kod、Vent、Sac、Mth、Pho、Tf1、Pfu、Tru、Tth、Phi29、Tl1和Pwo；
优选地，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括iPLEX延伸预混液；
优选地，所述延伸引物组存在于所述iPLEX延伸预混液中；
优选地，所述iPLEX延伸预混液中还含有如下组分中的至少一种：iPLEX缓冲液、iPLEX 终止混合液和iPLEX酶；
优选地，所述试剂盒还包括SAP消化预混液，所述SAP消化预混液含有SAP缓冲液和SAP
酶。
8.一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的核酸组或权利要求2-7任一项所述的试剂盒进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：进行多重PCR；所述多重PCR 的PCR反应体系中含有所述核酸组；
优选地，所述PCR反应体系中，所述核酸组中的每条引物的浓度为0.1-0.4μM；
优选地，所述PCR反应体系中含有UNG酶、dUTP、dATP、dCTP和dGTP；
优选地，在所述PCR反应体系中，dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度比为：0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1:0.9-1.1，更优选为：1:1:1:1；
优选地，所述PCR反应体系中，Mg2+浓度为2.4-2.6mM，更优选为2.5mM；
优选地，在所述PCR反应体系中，dUTP、dATP、dCTP和dGTP的浓度为500μM：500μM：500μM：500μM；
优选地，所述PCR反应体系含有DMSO。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在进行所述多重PCR后，所述方法包括：将得到的多重PCR产物进行单碱基延伸反应；所述单碱基延伸反应的延伸反应体系中含有所述延伸引物组；
优选地，所述延伸反应体系中，所述延伸引物组中的每条引物浓度为1.55-3.15μM。
基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合
物、试剂盒和检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
[0002]基于MassARRAY平台的iPLEX技术利用单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，可以实现多重扩增反应基因型检测。主要特点为进行单管多重PCR，在PCR扩增产物中加入序列特异延伸引物，延伸引物设计位于突变位点前一个碱基，在突变位点处可延伸一个碱基。然后将制备的样用品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测，离子质量越小，就越快达到。MassARRAY SNP检测的质谱范围为4000到8500Dalton，检测过程大体可分为分子生物学反应、质谱阵列的点样和质谱检测三个过程。
[0003]2007年，美国FDA首次批准了采用药物基因组学检测方法判断常用抗凝药物-华法林的用量及敏感性。美国FDA已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，用于预测不同基因型患者在应用药物时的疗效和不良反应。
[0004]2015年国家卫生计生委医政医管局发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》
(以下简称“指南”)列出了药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及其用药指导，共包含26个靶点。
[0005]国家卫生计生委印发的《医疗机构临床检验项目目录2013年版》中“五、临床分子生物学及细胞遗传学检目录下4、用药指导的分子生物学检验”推荐进行CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G>C)、AGTR1(1166A>C)、ACE(I/D)、CYP2C19、CYP2C9、VKORC1、MTHFR (C677T)以及APOE基因检测。
[0006]目前单类药物用药相关基因检测产品已有获批，考虑到临床上心血管疾病多伴有其他并发症，患者常有多药物联用的情况，但由于药物间的相互作用、患者自身情况等多方面因素的影响，易导致不良反应的发生。所以针对心血管常用药，基因检测能更有效地指导患者用药。
[0007]血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统的重要体液因子，其90％以上的效应通过血管紧张素Ⅱ的1型受体(AGTR1)介导。AGTR1的1166A>C基因多态性可影响ARB类药物的效果，A/A基因型个体对ARB类药物更加敏感，降压效果更好。
[0008]血管紧张素转换酶(angio tensin converting enzyme，ACE)是肾素-血管紧张素系统的关键酶，由ACE基因编码，是ACEI类药物的作用靶点。ACE基因的第16号内含子中存在
插入(Insertion,I)/缺失(Deletion,D)序列，会导致ACE基因呈现I/D多态性，从而影响ACEI类药物的疗效。
2015年国家卫生计生委医政医管局发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》(以下简称“指南”)中建议临床上在选择ACEI类药物进行前对ACE I/D多态性进行检测，以指导选择合适的ACEI类药物。
[0009]β肾上腺素受体是β受体阻滞剂类药物的作用靶点，由ADRB1基因编码。该受体属于G蛋白偶联受体超家族，通过与Gs蛋白偶联调节细胞内cAMP和L型钙通道的开放频率。ADRB1的1165G>C多态性可影响β受体阻滞剂的疗效。“指南”中建议临床医师在应用β1受体阻滞药前进行ADRB1多态性检测，并根据其基因型调整用药剂量，以提高疗效。
[0010]CYP2D6是CYP450家族成员之一，已知经其催化代谢的药物多达80余种，CYP2D6基因多态性直接影响其酶活性，进而影响药物的代谢效率。不同个体CYP2D6活性最大可相差1000倍。中国人中CYP2D6常见的导致酶活性降低的等位基因是CYP2D6*10，该等位基因导致中间代谢(IM)表型，美托洛尔药物代谢效率降低。FDA建议在使用美托洛尔药物前先检测CYP2D6基因多态性，再根据基因型调整用药剂量，以提高疗效。
[0011]CYP2C9是CYP450家族成员之一，占肝微粒体P450总量的20％，该酶催化约12％的临床常用药物。中国人中主要存在的遗传变异为CYP2C9*3，导致酶活性降低。“指南”中建议CYP2C9*1/*3基因型个体中洛沙坦的降压作用下降，需适当增加用药剂量以增强降压疗效。
[0012]5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)能催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成，是叶酸代谢过程中的关键酶。中国高血压患者通常伴有同型半胱氨酸增高，在叶酸缺乏的情况下极大地增加了心血管事件的发生概率。通过基因筛查出高危人，叶酸降低同型半胱氨酸浓度，减少脑卒中等心血管事件发生率。降压药物联合叶酸补充可更有效地降低MTHFR677CC基因型H型高血压患者血压水平。[0013]由中华医学会心血管病学分会、中国老年学学会心脑血管病专业委员会共同制定的《华法林抗凝的中国专家共识》指出，华法林相关的药物基因(P450 2C9和VKORC1)多态性可导致对华法林的需求量减少，还与副作用增加有关。
[0014]美国FDA提醒应用氯吡格雷后出现心血管不良事件与CYP2C19功能缺失的等位基因有关，结合中国人的临床证据，建议如果ACS/PCI患者携带CYP2C19强代谢或超强代谢基因型(*1/*1、*1/*17和*17/*17)，推荐使用氯吡格雷标准剂量，如果患者携带CYP2C19功能缺失基因型，建议使用其他抗血小板药物(如普拉格雷、替格瑞洛)。
[0015]目前，基于核酸质谱技术检测多种心血管疾病用药相关基因仍然具有一些缺点，例如特异性不好，效率低，灵敏度低，峰值图不便于识别等。
[0016]鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0017]本发明的目的在于提供一种基于核酸质谱技术检测心血管疾病用药相关基因的核酸组合物、试剂盒和检测方法。使用本发明提供的核酸组合物、试剂盒或检测方法，采用核酸质谱技术可以检测心血管疾病用药相关基因的16个位点的基因型，其具有灵敏度高，特异性强，结果易于识别，并提高了准确性，操作方便等特点，本发明为心血管疾病用药相关基因的检测提供了更为可靠的检测手段，也为心血管疾病的个体化用药提供了更为合理核酸结果查询