新冠病毒核酸检测SOP
新冠病毒核酸检测SOP
1.目的
根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》，规范本中心新型冠状病毒感染的肺炎的检测方法。
2.适用范围
体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的口咽拭子、鼻咽拭子和痰液样本检测。
3.职责
3.1检测人员：负责按照本检测细则对被检样品进行检测；
3.2复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；
3.3科室负责人：负责对科室综合管理和检测报告的签发。
4.检测依据
《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》
5.操作程序
5.1实验前准备
5.1.1检测人员进入污染区前，必须穿好一次性防护服、一次性帽子、N95口罩、双层手套、一次性靴套、护目镜、防护面屏不得将与实验无关物品带入实验室。
5.1.2调节室温至20-25℃，湿度20-80%。
5.1.3检测试剂在室温平衡半小时;并检查试剂是否在有效期内。
5.1.4检查仪器是否正常，做好检测前准备工作。
5.1.5开启实验室污染区生物安全柜
5.2实验方法见试剂说明书
【检验方法】
5.2.1试剂准备（试剂准备区）
从试剂盒中取出核酸扩增反应液、酶混合液、ORF1ab/N反应液，室温融化，充分振荡混匀后瞬间离心。
计算试剂使用份数N（N=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），根据下表配置反应体系，加入一适当体积离心管中，充分振荡混匀后瞬间离心，按20μL分装至PCR 反应管中，并转移至样本处理区。
组分名称加入体积（μL）/人份
核酸扩增反应液12
酶混合液4
ORF1ab/N反应液4
总体积20
5.2.2样本处理（样本处理区）
①核酸提取：待测样本、阳性对照及阴性对照按照核酸提取试剂盒说明书进行操作。
②加样：在上述准备好的PCR反应管中分别加入待测样本核酸、阳性、阴性对照各5μL，终体积为25μL/管，盖紧管盖，瞬时离心。
5.2.3PCR扩增检测（核酸扩增区）
①将PCR反应管置荧光定量PCR仪扩增检测。
插上仪器电源线，打开仪器背部的电源开关，仪器开机初始化。等待至指示灯停止闪动，变成稳定绿，进入下一步操作。
②打开电脑桌面qsoft4.1软件，进入qsoft4.1用户界面，表明仪器与电脑连接成功，进入下一步操作。
③新建程序：单击菜单栏中“项目”，创建新的程序。或者调入已保存的PCR程序模板文件，运行程序。
④若创建新程序，点击创建项目。设置PCR基本参数、文件名、反应体系、操作者等。
⑤设置实验程序，温度循环设置按试剂盒说明书中“循环参数设定”设置（如图）。
循环参数设定
步骤温度时间循环数
1逆转录50℃10min1cycle
2预变性95℃5min1cycle
3变性95℃10s
40cycles 退火/延伸/检测荧光55℃40s
说明：
A、步骤3中55℃时设置荧光检测。
B、在勾选基因通道时需要填写检测信号（管1，在此处可以填写检测基因信号或者1,2,3,4）
点击保存，保存我们所创建的新程序。
⑥在界面左下角点击Home，实验Home界面提供了多种进入实验向导的入口，用户点击实验向导。
⑦更改文件名、操作者，勾选模块，基因通道默认为我们所设置的，如需要可勾选全通道扫描。
⑧“孔板编辑”设置样品孔定义，根据我们样品数设置孔板，点击右下侧的样本项目，进行样本类型的更改，设置阴阳对照。
⑨反应条件全部设好后，打开仪器蓝滑盖，放入样品，盖上盖子，点击“实验运行”，再点击开始，即可开始运行程序。停止程序，暂停程序。运行程序前，会要求设置好结果文件保存路径，运行结束后，结果文件自动保存在指定的文件夹中。
⑩结果分析参数设定
根据分析后扩增曲线图调节起止值，（建议起始设在3～15、终止设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击分析，在报告界面查看结果。
【阳性判断值】
根据临床样本检测结果，利用ROC曲线法确定ORF1ab、N
参考值均为Ct值等于38。
【检验结果的解释】
质控标准
以下要求需在同一实验中同时满足，否则本次实验无效序：
通道
检测靶标阴性对照阳性对照
FAM通道ORF1ab无Ct值Ct≤30
HEX/VIC通道N无Ct值Ct≤30
ROX通道内参—Ct≤30
结果判读
检测通道
结果判读FAM通道HEX/VIC通道ROX通道
Ct值≤38Ct值≤38Ct值≤38样本阳性无Ct值或Ct值>38无Ct值或Ct值>38Ct值≤38样本阴性无Ct值或Ct值>38Ct值≤38Ct值≤38
复测* Ct值≤38无Ct值或Ct值>38Ct值≤38
*痰液样本：建议复测，如复测结果两个通道均为Ct值≤38则结果判读为阳性，否则为阴性；口咽拭子和鼻咽拭子：建议采集痰液样本进行复测，并按照痰液样本的标准进行结果判读，即两个通道均为Ct值≤38则结果判读为阳性，否则为阴性。
实验结束后，打开仪器蓝滑盖，取出八联管丢弃，并依次关闭PCR仪电源和电脑电源。
6仪器维护
6.1仪器的表面应每周用软抹布加少量清水擦洗1次，清洁后将仪器擦干；
6.2若有试剂泄漏在仪器表面，应用软抹布加75%酒精擦拭干净；
6.3清洁仪器前必须关闭电源，并拔掉电源线；
6.4不要将液体倾倒在模块中或者仪器内部；
6.5不能用强腐蚀性溶剂或者有机溶剂擦洗仪器；
6.6反应孔沾染灰尘或杂质后，会影响PCR扩增和荧光检查，因此要每3个月用吹气球轻轻吹拭；
6.7若有试剂泄漏在反应孔内，应用无尘纸或者无尘布加75%酒精擦拭。
6.8仪器不使用时，要盖上方机。
7操作注意事项
核酸检测结果阳性参考值阴性
7.1实验室操作按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》进行。实验操作必须严格分区，各区域使用的仪器、设备、耗材和工作服必须专用，不得交叉使用，避免污染。
试剂盒不同批号的组份不可以互换使用，各组份使用前应室温融化，充分振荡混匀，瞬间离心后使用。
7.2反应液分装时应避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧。
7.3实验结束后，应及时清理台面，并用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯等措施