不同采血管对核酸检测结果的影响
采用核酸检测( NAT) 技术对献血者血液标本进行筛查，采血管是提高血液安全性的重要举措。NA T 技术的灵敏度极高，其缩短检测窗口期的能力远远高于血清学方法，但是如果标本的采集、处理、保存不当，会造成病毒核酸降解，从而影响检测结果的真实性，降低核酸检测本身的灵敏度，对血液安全带来潜在风险。对此，试剂和采血管的厂方说明书都提出了各自对于标本处理的指导意见。但是不同实验室标本采集过程，运输、保存条件不尽相同，对标本质量的影响也存在差异。为确保血液标本满足NAT 检测要求，我们采用不同的试验方案，验证不同品牌无菌无RNAase 真空采血管、保存温度、离心前保存时间等对NA T 检测结果的影响。为选择符合NAT 要求的采血管、优化标本控制过程、制定核酸检测策略等提供数据支持。
1 材料与方法
1. 1 材料1) 采血管: 从市售采血管中选择3 种EDTA K2抗凝的，有分离胶，一次性无菌无RNAase 真空采血管，根据生产厂家不同，称为A、B、C 采血管。2) 检测标本: 试验用阴性标本: 对献血者全血标本进行血清学检测和NA T 检测，将检测结果呈HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA 阴性的标本进行汇集，作为试验用阴性标本。试验用HBV 阳性血浆: 从HBsAg、HBV DNA 检测结果呈阳性，其余项目检测结果呈阴性的献血者全血标本中分离的血浆，经HBV DNA 定量检测，HBV 浓度为1. 24
×104IU / ml。试验用HCV 阳性血浆: 从抗-HCV、HCV RNA 检测结果呈阳性，其余项目检测结果呈阴性的献血者全血标本中分离的血浆，经HCV RNA 定量检测，HCV 浓度为  6. 88 × 103IU / ml。试验用HIV-1 阳性血浆: 从抗-HIV、HIV-1 RNA 检测结果呈阳性，其余项目检测结果呈阴性的献血者全血标本中分离的血浆，经HIV-1 RNA 定量检测，HIV-1 浓度为  1. 08 × 105IU / ml。3) 试剂: NA T 联检和鉴别检测分别采用，NAT 定量检测采用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test 试剂( 批号: N11304，，血清学检测所用试剂均为血液中心常规检测试剂。4) 检测设备: NAT 联检和鉴别检测采用ProcleixTigris 系统，NA T 定量检测采用Roche CAP / CTM 系统。
1. 2 标本保存温度、离心前保存时间及采血管对NA T 联检试验结果的影响将血清学和NA T 检测结果均呈阴性的全血标本，以每  6 份标本混为  1 份的原则进行混匀; 向混匀后的标本中加入已知浓度的HBV 或HCV 或HIV-1 阳性血浆，使HBV 或HCV 或HIV-1 的终浓度分别为50 IU/ml、60 IU/ml 和150 IU / ml; 混匀后的全血标本分别分装至采血管A、B、C 中，形成3 组试验标本，分别标记为A 组、B 组和C 组。然后每组标本再分为  2 个亚组，分别置于4℃和30℃保存; 于0h( 阳性对照) 、4、6、8、10、12、24 h 分别取一定数量的标本，在1 000 g 条件下离心10 min，之后在原温度下继续保存; 在25h 进行NA T 联检检测，统计分析检测结果。
1. 3 标本保存时间、采血管对NAT 鉴别试验结果的影响按照  1. 2 所示方法将制备好HBV( 50 IU/ml) 、HCV( 60 IU/ml) 或HIV-1 ( 150 IU / ml) 的弱阳性全血标本混匀后分装至A、B、C 3 种真空采血管中，形
成  3 组试验标本。再将不同组、不同病毒种类的标本分为7 个小组，全部标本在  1 000 g条件下离心10 min 后在4℃保存。依次于0 d( 阳性对照) 、1、2、3、4、5、6、7 d 的同一时间取  1 组标本进行NA T 鉴别检测。分析统计不同保存时间对HBV 或HCV 或HIV-1 弱阳性标本NA T 鉴别试验结果的影响。
1. 4 保存时间对HCV 阳性标本NA T 定量结果的影响选取9 份检测结果呈抗-HCV、HCV RNA 阳性，HBsAg、抗-HIV、HBV DNA、HIV-1 RNA 阴性的献血者全血标本，使用血清学及NA T 检测结果均呈阴性的血浆分别进行稀释，使其成为HCV 含量在  1. 04 × 102IU / ml ～  4. 86 × 103IU / ml 之间的弱阳性标本。再将每个弱阳性标本等量分成8 份放置于真空采血管  A 中。全部标本在  1 000 g 条件下离心10 min 后，4℃保存。依次于0、1、2、3、4、5、6、7 d 的同一时间取1 组标本进行定量HCV RNA 检测。分析研究4℃保存条件下保存时间对血浆中HCV RNA 浓度的影响。
1. 5 统计学方法标本保存温度、标本离心前保存时间及采血管对NAT 联检试验结果影响的研究、及标本保存时间对NAT 鉴别试验结果影响的研究均采用卡方检验进行实验结果的统计分析; 保存时间对HCV 阳性标本定量结果影响的研究采用SPSS 17. 0 软件进行重复测量数据的方差分析。P ＜0. 05 和＜
0. 01，认为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 标本保存温度、离心前保存时间及采血管对NA T 联检试验结果的影响表1 显示了A、B、C 3 种采血管，在4℃或30℃、24 h 内保存全血标本时，含HBV( 50 IU / ml) 、或HCV( 60 IU/ml) 、或HIV-1( 150 IU/ml) 的弱阳性标本的NAT 检出率。结果证实，4℃或30℃保存全血标本时，4 ～24 h 的离心前保存时间对弱阳性标本NA T 检出率的影响差异无统计学意义( P ＞0. 05) ，同时，试验结果还表明，在24 h 内，4℃或30℃的保存温度对于弱阳性全血标本NAT 检出率的影响差异无统计学意义( P ＞0.
05) ，均能保证标本中病毒核酸的稳定。在4℃或30℃、24 h 内保存弱阳性全血标本时，不同采血管的保存效果差别无统计学意义。核酸检测结果阳性参考值阴性
2. 2 标本保存时间、采血管对NAT 鉴别试验结果的影响表2 显示在4℃保存7 d 内，采用C 采血管保存含HIV-1( 150IU / ml) 、或HCV( 60 IU / ml) 、或HBV( 50 IU / ml) 弱阳性标本的检出率均为100%。说明  C 采血管对弱阳性标本的NA T鉴别试验检出率没有明显影响。同时采用  A 采血管保存含HCV( 60 IU / ml) ，采用B 采血管保存含HIV-1( 150 IU / ml) 和含HCV( 60 IU/ml) 的弱阳性标本时，NAT 检出率没有显著变化。但是采用  A 采血管，保存含HIV-1( 150 IU/ml) 和HBV( 50 IU / ml) 的弱阳性标本，在保存后  d 2 时都出现了标本NA T 鉴别试验检出率差异有统计学意义( χ2= 4. 36，P ＜0. 05; χ2= 11. 68，P ＜0. 01 ) ，其NA T 检出率分别从0 d 的100% 和97% ，下降至91% 和63% 。而且在保存含HIV-1( 150 IU/ml) 的弱阳性标本d 3 时，该标本的NAT 检出率进一步下降至70%，与保存后d 2 相比，差异具有统计学意义( χ2= 9. 88，P ＜0. 01) ，保存至  d 4 后，A 采血管中保存的含HIV-1( 150 IU / ml) 的弱阳性标本的NA T
检出率略有上升，维持在稳定水平但  d 4、d 5、d 6、d 7 该弱阳性标本的NA T 检出率与0 d 相比，差异仍具有统计学意义( χ2依次为7. 62，19. 53，14. 83，9. 71，P ＜0. 01 ) 。而采用  B 采血管保存含HBV( 50 IU / ml) 的弱阳性标本时也曾出现NAT 鉴别试验检出率下降的现象，分别出现在保存后的
d 3 和d 7( NA T 检出率均为83%) ，与保存前相比差异有统计学意义( χ2= 10. 91，χ2= 10. 91; P ＜0.
01) 。
2. 3 保存时间对HCV 阳性标本定量结果的影响9 份HCV 弱阳性标本在4℃保存7 d，每天在相同的时点进行定量HCV RNA 检测，结果显示，9 份标本的浓度7 d 内没有出现明显变化，每份标本7 d 内的浓度变化均在0. 56 log 之内( 表3) ，且有相同的变化趋势( 图1) 。使用SPSS 软件分析9份标本的浓度变化，整合统计后输出HCV 弱阳性标本浓度均值变化趋势见图2。从图  2 可以看出，在4℃保存7 d 内，HCV 弱阳性标本浓度的均值变化较小，其变化范围为0. 24log 以内。同时，图2 也显示在4℃保存2 d 后，HCV 弱阳性标本的浓度开始下降，保存至  d 4、d 5 时，其浓度较  d 2 差异出现统计学意义( P ＜0. 01，P ＜0. 05) 。随后在保存的  d 6时又出现上升，与  d 5 相比较差异显著( P ＜0. 01) ，但仍低于保存  d 2 时的浓度。
3 讨论
本研究旨在通过探究不同标本保存条件、不同采血管对于血液标本中HBV、HCV 和HIV-1 的稳定性的影响，明确实验室对NAT 标本的控制要求，为实验室检测前过程控制策略的制定提供数据支持。我们的研究显示，保存温度( 4℃或30℃) 和离心处理时间( 采集后24 h 内) 对含HBV( 50 IU /ml) 、HCV( 60 IU / ml) 、HIV-1 ( 150 IU / ml) 的弱阳性标本的NAT 检测结果的影响无统计学意义。Damen 等也报道含有HCV 的血清标本30℃保存时，直到d 7 才会出现HCV 浓度的显著下降。文献［2，3］报道HIV-1 在室温条件下是比较稳定的，能够稳定保存30 h 以上。HBV 病毒也有较好的稳定性。另外该研究中  3 种采血管的联检试验结果没有显著差异。所以在不超过30℃的采血环境中，NA T 标本的现场保存，只需和采集的血液一样保存即可，并在采集后24h 内离心处理，如此操作不会对HBV、HCV、HIV-1 弱阳性本d 2 的检测质量产生影响。
我们的研究表明，在4℃保存7 d 内，采用C 采血管保存含HIV-1( 150 IU/ml) 、或HCV( 60 IU/ml) 、或HBV( 50 IU/ml) 弱阳性标本的检出率均为100% 。同时采用  A 采血管保存含HCV( 60 IU/ml) ，采用B 采血管保存含HIV-1( 150 IU/ml) 和含HCV( 60 IU / ml) 的弱阳性标本时，NAT 检出率没有显著变化。
Gessoni 等将血浆标本保存168 h 后，定量检测HBV，发现6 个标本中只有1 个出现显著下降。我们的研究结果与Gessoni 等的研究结果相同。Busch 等通过半定量的方法也发现在4℃保存7 d 时，HCV 的含量不会出现显著下降。Sener 等利用实时荧光PCR 技术对19 份浓度不一的HCV 标本进行定量分析后，也发现HCV 能在4℃保存5周以上。José等研究发现无论浓度多少，HIV-1 都能在5℃条件下至少稳定保
存14 d。但是值得关注的是采用  A 采血管时，从4℃保存  d 2 起，含HIV-1 弱阳性标本的NAT 检出率开始下降，及至  d 3 时，出现显著下降。采用  B 采血管保存含HBV( 50 IU/ml) 的弱阳性标本时，在4℃保存的d 3，也出现了含HBV 弱阳性标本的NA T 检出率下降的现象。而这一现象也在Gessoni 等的试验中得到过印证。Gessoni 等发现4℃保存血浆标本72h 时，2 /6 的HCV 标本以及  1 /6 的HIV-1 标本首次出现下降。这可能是由于单核细胞释放的脂酶破坏病毒核衣壳，进而RNAase 降解病毒造成的。另外采用  A 采血管在4℃保存d 2 时，HBV 弱阳性标本的NAT 检出率为63% 。同时观察到该HBV 阳性对照组的NA T 检出率低于100%，为97%。分析原因可能由于该组标本浓度接近Procleix Tigris 检测系统的检测下限，从而导致该组标本的阳性对照组不能100% 检出，而且同时由于标本制备过程中的随机误差造成63%这样的离值产生。保存时间对HCV 阳性标本定量结果的影响研究显示，
试验标本在4℃保存7 d 内，9 份弱阳性HCV 标本的含量没有出现显著的变化，保持在  1 个稳定的范围内。这与前面
2. 2 试验中弱阳性标本的NAT 鉴别实验检出率变化情况相一致。另外所有9 份标本浓度变化的总体趋势相一致，即在d 1 稍下降，但是不显著。d 2，含量有了显著性的上升，之后又显著下降、再上升后下降。该实验结果与Gessoni 等的实验结果类似。Gessoni 等研究发现，24 h 后，4/6 的HCV 标本，含量出现上升，之后几天，HCV 含量逐渐下降，在4℃保存24 h 后出现HCV 浓度上升现象的原因不明。Gessoni 等还发现3/6 的HBV 标本，4/6 的HIV-1 标本也会出现在4℃保存24 h 后浓度上升这种现象。Ke
ssler 等采用2 种ED-TA 采血管室温保存HCV 血清标本96 h，含量出现显著地上升。Krajden 等发现在4℃保存  4 d 后，HCV 含量增加了31% 。类似的结果还在文献［13，14］中出现过。
综合上述研究结果，我们认为在NA T 实验室常规工作中，在4℃保存献血者标本时可以在NA T 联检阳性后7 d 内进行NA T 阳性标本的鉴别试验，但考虑到采用  A 采血管保存含HIV-1 弱阳性标本、采用B 采血管保存含HBV( 50 IU/ml) 的弱阳性标本时，在4℃保存2 d 后出现的NAT 检出率下降现象，以及9 份HCV 弱阳性标本的浓度变化趋势，建议在NAT 联检阳性后  2 d 内完成NAT 鉴别检测，以提高鉴别阳性率。由于我们实验所用阳性标本浓度较低，可能导致个别实验数据出现一定偏差，我们将进一步对研究结果进行验证。